當歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究

1、當歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究當sinensis(Oliv.)Diels的干燥根.當歸根人藥,有補血活血,調經止痛,潤腸通便和調控免疫活性的功效【21.臨床用量大,出口量大,主產甘肅岷縣,渭源,隴西,宕昌等地I.其主要成分有揮發(fā)油,多糖,阿魏酸等41,此外還含少量鉀,鈣,鎂,鋅,硒等微量元素.近年來,對當歸的深度開發(fā)在醫(yī)藥,保健品和化妝品領域取得了一定成效.當歸的主要功能成分一直被認為是揮發(fā)油和阿魏酸,近年來國內外醫(yī)學專家研究發(fā)現當歸還有抗缺氧,抗癌,康膚美容,補血活血,抑菌,抗動脈硬化作用等I51.黃酮是廣泛存在于自然界的一大類化合物,存在于植物的所有部分,包括根,心材,樹皮,葉,果實

2、和花中.其在植物體內大部分與糖結合成苷類,小部分以游離態(tài)(苷元)的形式存在【.黃酮類化合物大多具有顏色,在生理方面具有降低心肌耗氧量,增加冠狀動脈和腦血管血流量,增加機體免疫功能,抗心律失常,軟化血管,降血糖,降血脂,清除機體自由基和抗衰老等作用I7I.筆者等以甘肅隴南當歸為對象,考察其提取工藝及抗氧化性,為當歸的進一步開發(fā)利用提供科學依據.1材料與方法1.1原料及處理方法當歸:采自甘肅隴南.將當歸根經自來水,蒸餾水洗凈,烘干,粉碎過60目篩,備用.1-2主要試劑鄰苯三酚:美國Sigma公司;Tris:加拿大BioBasic公酸,30%過氧化氫,i氯乙酸(TCA),磷酸緩沖液(pH值為7.40

3、,pH值為6.60)(PBS),無水乙醇,亞硝酸鈉,硝酸鋁,氫氧化鈉,三氯化鐵,鐵氰化鉀等試劑均為分析純;試驗用水為三蒸水,所用儀器均經自來水,三蒸水清洗備用.1.3主要儀器GB204電子天平:梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司;RE一52C型旋轉蒸發(fā)儀:鞏義市英峪予華儀器廠;SHZD(1lI)循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限責任公司;DK一98一型電熱恒溫水浴鍋:天津市泰斯特儀器有限公司;WFJ一2100型分光光度計:尤尼柯(上海)儀器有限公司;Lambda系列紫外/可見分光光度計:美國PerkinElmer公司;800型離心沉淀器:上海手術器械十廠;YLD一2100電熱恒溫鼓風干燥箱:上

4、?，槡瀸嶒炘O備有限公司.1.4黃酮含量測定原理及鑒定方法1.4.1測定原理黃酮類化合物主要包括黃酮苷和黃酮醇苷兩大部分.在黃酮類化合物溶液中加入鋁離子試劑后,黃酮類化合物中的酚羥基與Al生成絡合物,控制適宜的pH值,所生成的絡合物在可見區(qū)能獲得特征吸收峰,其質量濃度與吸光度符合朗伯一比耳定律,可以定量測定8.1.4.2金屬鹽類試劑的絡合反應鹽酸一鋅粉反應:在樣品液中加入少量鋅粉,再滴加1-2滴濃鹽酸,在沸水中加熱3min,觀察反應結果.鋁鹽反應:在樣品液中滴加10%A1C1,溶液,觀察反應結果.濃硫酸反應:在樣品液中滴加少量濃H2SO溶液,觀察反應結果.硝酸鉛反應:在樣品液中滴加10%Pb(N

5、O,),溶液,觀察反應結果.氫氧化鈉反應:在樣品液中滴加4%NaOH溶液,觀察反應結果.1.4.3單因素試驗分別以提取溫度,乙醇濃度,提取時間,料液比為影響因素,設置4個因素的不同水平,以確定相關因素對當歸提取液中總黃酮含量的影響.調查研究1.5.2標準曲線的繪制1.5.2.1蘆丁標準溶液的配制準確稱取105oC常壓干燥至恒重的蘆丁標準品10.0mg,用少量75%乙醇加熱溶解,待冷卻后轉移至50mL的容量瓶中,定容至刻度,充分混勻.蘆丁標準品的濃度為0.2000rag/mE,備用.1.5.2.2測定波長的選擇按上述方法制備標準溶液,以不加標準溶液的相應溶液為空白,在波長400760nm進行連續(xù)

6、掃描.結果在波長509nm處有最大吸收,因此選擇509nm為測定波長.1.5.2.3標準曲線的繪制精確吸取蘆丁標準溶液0.O0,0.50,1.O0,1.50,2.O0,2.50,3.O0,3.50mL,分別置于10mL的具塞試管中,先加5%亞硝酸鈉溶液0.40mL,搖勻,靜置6min;再加10%硝酸鋁溶液0.40mL,搖勻,靜置5rain;最后加入4%氫氧化鈉4.O0mL,用75%乙醇定容,搖勻,靜置15rain,以蘆丁試劑空白作參比,用分光光度計于509nrfl處測定吸光度.1.5.3回收率試驗精密量取一定量在最佳提取工藝條件下的當歸總黃酮提取液,加入0.2000mg/mL蘆丁標準液1.O0

7、mL,最后定容至10mL.測量吸光度,計算黃酮回收率.1.5.4精密度試驗根據正交試驗的分析結果,依照最佳提取工藝進行提取,對當歸樣品平行提取5次,測定黃酮含量,計算精密度.1.6體外抗氧化性試驗1.6.I提取液對羥基自由基的清除效果按照Smimoff的方法,利用H0與Fe”混合,產生?OH,在體系內加人水楊酸捕捉?OH,并產生有色物質,該有色物質在510rim下有最大吸收,故通過測定A.值可以定量判斷?OH的清除程度,并可以估算出?OH的清除率.取不同量一定濃度的提取液,加入9.O0mmol/LFeSO41.O0mL,9.O0mmoJL水楊酸一乙醇溶液1.O0mL,再加8.80mmol/LH

8、:01.O0mL,用蒸餾水補至5.00mL,于37下反應30min,以蒸餾水作參比測定A.值(A),以9mmol/LFeSO41.O0mL,9.O0mmol/L水楊酸一乙醇溶液1.O0mL,移取一定量提取液,用蒸餾水補至5.O0mL,于37下反應30rain作為本底吸收值(A蚰),以9mmo1LFeSO1.O0mL,9.O0mmol/L水楊酸一乙醇溶液1.O0mL,蒸餾水1.O0mL,8.80mmo1LH2021.O0mL,用蒸餾水補至5.O0mL,于37下反應30rain作為空白(A0),均測定其A,.值.按以下公式計算自由基清除率(C):C(%):Ao-(A.x-Axo)100A01.6.

9、2提取液對超氧陰離子的抑制作用I111在堿性條件下(pH值8.20)鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應,生成02_?和有色中間產物,該有色產物在322nm處有一特征吸收峰.當加入0:一?清除劑時,0一?的生成被抑制,鄰苯三酚自氧化速率受阻,溶液在322nm處吸收減弱,故通過測定A值可以推測提取物對02-?的清除作用,并比較不同提取物添加量對02-?清除作用的相對大小.取3支10mL比色管,各加入pH值8.20的TrisHCI溶液2.O0mL,再依次分別加入0.O0,0.50mL一定濃度提取液(LE)和0.2mg/mL抗壞血酸溶液0.50mL,最后均加0.2mmol/L鄰苯三酚溶液1.O0mL,加水定容至刻

10、度,在波長322nm處以時間模式記錄45rain內每隔30s吸光度的變化.另取10支10mL比色管,各加pH值8.20的TrisHC1溶液2.O0mL,再依次分別加入0.O0,0.20,0.40,O.60,0.80,1.00,1.20,1.40,1.60,1.80和2.O0mL一定濃度的提取液(LE),最后均加0.2mmol/L鄰苯三酚溶液1.o0mL,加水定容至刻度,在波長322ilm處以時間模式記錄5rain內每隔30S吸光度的變化,并計算提取液對超氧陰離子自由基的抑制率.抑制率按下式計算:抑制率(%)=(A,t一At)/(A./t)X100式中:A/ZXt為鄰苯三酚自氧化速率,At為加入

11、提取物以后鄰苯三酚自氧化速率.1.6.3提取物還原力的測定普魯士蘭法【I2】.吸取不同量一定濃度的提取液,分別加入0.2mol/LpH值6.6的磷酸鹽緩沖液和濃度為1%KFe(CN)溶液各2.50mL,混合均勻,混合液在5O水浴中保溫20rain后,加10%的TCA溶液2.50mL,混合后3000r/rain離心10rain.取上清液2.50mL,加蒸餾水2.50mL和0.1%FeCI3溶液0.50mL.測定反應液在700am處吸光度值,用吸光度大小表示還原力強度.2結果與分析2.1黃酮類化合物的鑒定顯色反應結果見表2,表明當歸中含有黃酮類化合物.表2顯色反應結果結果淺黃_橙紅輕微渾濁淺黃亮黃

12、淺黃_+紅褐色淺黃J+向色絮狀沉淀2.2單因素試驗2.2.1料液比的影響準確稱取1.O000g當歸樣品于100mL圓底燒瓶中,在提取溫度為60,提取時間為2h,乙醇濃度為65%,提取次數為3次條件下,經旋轉蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100mL容量瓶,分析料液比對提取當歸中總黃酮的影響.結果見圖1.由圖I可以看出,當料液比為1:40時,吸光度達到最大值,說明總黃酮含量達到峰值.當繼續(xù)增加料液比時,吸光度反而下降,可能是料液比增加到一定程度時,原料內部與溶劑之間溶質已經達到平衡,反而使雜質溶解增加,相應降低了吸光度值”1.料液比圖1料液比對當歸總黃酮提取量影響2.2.2乙醇濃度的影響準確稱取

13、1.0000g當歸樣品于100mL圓底燒瓶中,在提取溫度為60,提取時間為2h,料液比為1:40,提取次數為3次的條件下,經旋轉蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100mL容量瓶,分析乙醇濃度對提取當歸中總黃酮的影響.結果見圖2.由圖2可以看出,當乙醇濃度為75%時,吸光度達到最大值,說明總黃酮含量達到峰值.當繼續(xù)增加乙醇濃度,吸光度反而下降.實驗結果表明,以75%乙醇進行提取為宜.5505口掣群0_.d0%45%50%55%B0%55%70%75%目0%85%乙醇濃度/%圖2乙醇濃度對當歸總黃酮提取量影響2.2.3提取時間影響準確稱取1.0000g當歸樣品于100mL圓底燒瓶中,在乙醇濃度為7

14、5%,提取溫度為60,料液比為l:40,提取次數為2次的條件下.經旋轉蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀,冷卻后定容至100mL容量瓶,分析提取時間對提取當歸中總黃酮的影響.結果如圖3所示,隨著提取時間的延長,吸光度逐漸增加,但是3h以后吸光度反而下降.2.2.4實驗04督口42圖3提邱100mL圓料液比為儀濃縮至:溫度對提:以看出,陽度達到類物質在高溫下遭到破壞,或者其它雜質被提取出來,不利于進一步的分離純化Il41.O10203040507O901oo提取溫度/C圖4提取溫度對當歸總黃酮提取量影響2.3標準曲線與回歸方程見圖5.OO01012000005006O07口舶蘆丁濃度/mg-圖5標準回歸曲線2.

15、4正交試驗采用(3)正交試驗對當歸提取液進行分析,以黃酮提取量為指標,研究各因素間相互作用下的最佳提取工藝.結果見表3.調查研究取時間為3.5h,料液比為1:30,提取次數為2次.在此工藝條件下得到的總黃酮提取量為9.4642mg/g.2.5精密度試驗結果見表4.表4精密度試驗結果黃酮含量/rag9.21368.57888.77929.49768.87958.98974.04由表4相對標準偏差分析可得RSD為4.04%,在此工藝條件下得到的總黃酮提取量高,精密度良好.2.6回收率試驗由表5試驗結果可得,平均回收率為99.51%,說明該方法的回收率高,適合工業(yè)化生產.表5回收率試驗結果0.623

16、6o.657o0.2769o.26770-3l870.2n20.20.20.2o.8236o.857o0I4769o.46770.5l870.83410.84240.46l50.46320.5300l01_2798_3096.7799.5l99.O3102.132.7體外抗氧化性試驗結果2.7.1提取液對羥基自由基的清除效果試驗結果表明,當歸黃酮對羥自由基(?OH)的清除率隨著添加量的增加而增加,當提取液總黃酮濃度為0.068mg/mL時,清除率可達到74.02%,說明提取液對羥自由基有較好的清除作用.而且總黃酮濃度與清除率基本呈線性相關,見圖6.提取液體積(X)與清除率(Y)關系的回歸方程為

17、:Y=一3.904+1175.40107X(R=0.99655)000001O02O03O04O05006007濃度/nagmL圖6當歸總黃酮提取液對?OH的清除效果2.7.2提取液對超氧陰離子的抑制作用結果見圖7.由圖7可見,當加入一定的提取液后,隨著時間的推移,鄰苯三酚自氧化曲線明顯降低,說明提取液對鄰苯三酚的自氧化有明顯抑制作用.圖7鄰苯三酚自氧化曲線試驗結果表明,當歸黃酮對超氧陰離子(O一?)的清除率隨著添加量的增加而增加,當提取液總黃酮濃度為0.034mg/mL時,抑制率可達到51.79%,說明提取液對Oz一?有較好的抑制作用,見圖8.且總黃酮濃度(x)與抑制率(Y)呈線性相關:Y=

18、4.266+1399.25134X(R=O.99558).1/j/j/I.,一000000D口0O23O00,5濃度/ragmL圖8當歸總黃酮提取液對鄰苯三酚自氧化抑制作用陽帥如仲0*鍾察醉器囂2.7.3提取物還原力測定當歸黃酮具有良好的還原能力.圖9結果表明,隨著提取液加入體積的增大,還原力逐漸增強.當加入0.08mg/mL提取液2.O0mL時,吸光度為0.566,說明黃酮是良好的供電子基團.黃酮供應的電子除可以使Fe還原為Fe”,還可以與自由基成為較惰性物質,以中斷自氧化連鎖反應.提取液體積(X)與吸光度(Y)關系的回歸方程為:Y=0.06013+0.26433X(尺=0.99592)體積/mL圖