不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞生物學特性

1、不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞生物學特性的影響         11-03-24 10:11:00     編輯：studa20                  作者：居會祥, 戴真煜, 孫明忠, 呂晶晶 【摘要】  目的： 研究不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用

2、下對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。方法： 采用共沉淀法制備得到不同粒徑FeOx，將不同粒徑FeOx吸附于細胞表面，并加載靜磁場(SMF)及100 Hz交變磁場(EMF)照射。運用CCK8檢測納米粒子吸附后在外加磁場作用下Bel7402細胞增殖情況，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡、死亡率及細胞周期變化。結果： 不同粒徑磁性納米FeOx在SMF照射時間低于72 h時能使Bel7402細胞增殖速度增快，當照射時間大于72 h時，細胞增殖速度未發(fā)生明顯變化但部分細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(3.1±0.78)。而經(jīng)EMF照射后37 nm FeOx吸附細胞增殖被抑制，細胞周期實驗結果表明大部分細胞被阻滯在G

3、0/G1期，細胞出現(xiàn)大量死亡與凋亡，凋亡率達到(23.34±3.6)、死亡率達到(57.24±2.7)。結論： 納米粒子未有外加磁場照射時不能對細胞產(chǎn)生明顯的影響，外加SMF照射時，細胞的增殖及DNA代謝未發(fā)生明顯的變化，但細胞發(fā)生凋亡；外加EMF照射時，細胞增殖被抑制并發(fā)生明顯的凋亡及死亡，細胞DNA代謝明顯紊亂，且具有較小粒徑的磁性納米FeOx在EMF作用下對肝癌細胞影響最為顯著。 【關鍵詞】  磁性納米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期AbstractObjective: To study the effects of different diamete

4、rs of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings, then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low

5、 frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields, CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis, death and cell DNA cy

6、cle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF, when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6) and (57.24±2.7)%, respectively, and the most of cells w

7、ere prohibited in G0/G1 period of DNA cycle.  Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced, but the apoptosis ratio of cells

8、was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation, apoptosis and DNA metabolism，furthermore, all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.Key wordsmagnetic nano FeOx； proliferati

9、on； apoptosis； DNA cycle   磁性納米材料具有良好的磁導向性、較好的生物相容性、生物降解性和活性能基團等特點1-3，它可結合各種功能分子，如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、控制釋放、酶的固定化、免疫測定、DNA和細胞的分離與分類等領域可望有廣泛的應用。磁性納米材料特別是Fe屬納米顆粒已經(jīng)被廣泛應用于藥物靶向治療及干細胞定向移植治療中4。當粒徑在30200 nm之間時，矯頑力和飽和磁化強度均達到最大值，且具有單疇特性。目前已有納米磁性氧化鐵等顆粒作為藥物或干細胞載體用于肝癌動物實驗的研究，但對磁性納米氧化鐵粒子本體對人體研究

10、相對較少5。本研究以肝癌細胞Bel7402為對象，觀察不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對其生物學特性的影響，旨在為FeOx用于治療肝癌提供實驗依據(jù)。    1  材料和方法    1.1  試劑及儀器    肝癌細胞株Bel7402購自中國科學院上海細胞庫。靜磁場發(fā)生儀為兩塊強磁場稀有金屬鎳/鐵永磁體，當兩塊磁體間距為2.5 cm時其場強為0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉計/高斯計為上海亨通磁電科技有限公司產(chǎn)品。變頻儀(FT1000型)為南京萬臣電子有限公司產(chǎn)

11、品，變壓器(PT800型)為上海富濟電子公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、Primilar1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，維生素C、青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產(chǎn)品。CCK8試劑盒為美國ADL公司產(chǎn)品，細胞凋亡及周期試劑盒均購自美國BD公司。FeSO4、醋酸鋅均為分析純，購自南京化學試劑有限公司。掃描電鏡(SEM)型號為HITACHIX650，X射線衍射儀(XRD)型號為Philips Xpert XRD system型。    1.2  方法1.2.1  磁性納米FeOx的制備 

12、;運用共沉淀法5以FeSO4及醋酸鋅為反應物，反應在乙醇、水（13）混合溶劑中進行并加入質(zhì)量百分比為2的甘油，制備得到醋酸亞鐵前驅(qū)體，前驅(qū)體粉末灼燒溫度為400，灼燒4 h后得到FeOx粉體，10 000 r/min離心30 min，得到上下兩層不同粒徑粉末，經(jīng)SEM及XRD實驗確定其粒徑及成分組成。SEM實驗前樣品用超聲清洗儀超聲分散10 min。XRD實驗條件為：掃描速率為2/min，測定納米粉體XRD譜。1.2.2  磁性納米FeOx吸附細胞實驗 將不同粒徑納米FeOx加入到細胞培養(yǎng)瓶中與細胞共同培養(yǎng)。納米粒子吸附細胞方法為：將細胞消化成細胞懸液并調(diào)整細胞濃度大于10

13、5個/ml，再將不同粒徑納米粒子加入到細胞懸液中并在恒溫搖床中勻速振蕩30 min，搖床搖速為200 r/min。振蕩完成后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)2 d后經(jīng)SEM實驗確定磁性納米FeOx結合效率。1.2.3  細胞培養(yǎng)   細胞種植到含10FBS PIMIRIER 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放置在37，5CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代時用胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）1 500 r/min 15 min離心洗滌2次，用含10FBS 1640培養(yǎng)基重懸細胞后種植細胞，每次細胞種植濃度應大于105個/ml。細胞臨時保存在-70超低溫冰箱

14、，永久保存在液氮罐中，細胞凍存液配比為DMEMFBSDMSO=721(體積比)，細胞凍存濃度應高于106個/ml。1.2.4  磁場照射細胞方法 靜磁場(SMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于兩塊永磁體之中，同時置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交變磁場(EMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于離工作線圈頂端2 cm，經(jīng)特斯拉計測量磁感應強度為0.67 mT，每間隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液進行各種檢測。1.2.5  CCK8細胞增殖實驗

15、 按試劑盒提供實驗方法進行。首先取出96孔酶標板，依照次序?qū)謩e加入50 l的標準品于酶標板微孔中，分別標記樣品編號，將50 l細胞培養(yǎng)懸液（2.5×104個/ml）加入到酶標板中；在標準孔和樣品孔中加入100 l的酶標記液，36孵育1 h，將溶液傾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 l，36下避光孵育反應15 min后加入終止液50 l，終止反應。測定450 nm的光密度值。每隔12 h重復進行以上步驟，72 h得到細胞增殖數(shù)據(jù)繪制細胞增殖曲線。1.2.6  細胞凋亡、死亡及周期實驗 細胞凋亡及周期實驗均在流式細胞儀上完成，均按試劑盒提

16、供實驗方法進行。凋亡實驗方法為：將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液，并用PBS洗滌2次并將細胞濃度重懸調(diào)整為106個/ml。染色過程為首先用微量移液槍移取20 l細胞懸液，然后用AnnexinV加入到細胞懸液中并避光靜置15 min后將PI染料加入并靜置30 min，染色完成后上機實驗。細胞周期實驗方法為：首先按凋亡實驗相同方法處理細胞以待上機檢測，染色方法為將試劑盒內(nèi)A，B，C，D 4種試劑按順序分別加入到細胞懸液中，避光靜置時間均為15 min。染色完成后上機實驗。流式細胞儀實驗條件為：細胞進樣流速中速，前向角補償電勢為56 V。1.2.7  統(tǒng)計分析 實驗結果用±

17、;s表示，使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，以=0.05為檢驗水準。2  結果    2.1  納米FeOx表征實驗結果    SEM及XRD實驗結果表明兩種粒子的平均粒徑分別為37，70 nm左右，粒子形狀為不規(guī)則球形（圖1，2）。根據(jù)Scherrer 公式：D=K/cos，其中D為粒子粒徑，K為形狀因子，為X 衍射的波長，為衍射峰的半峰寬，為衍射角。經(jīng)XRD實驗結果證明粒子中Fe，O兩種元素的比例為11.12。圖3為2種FeOx與Bel7402細胞吸附情況，圖中FeOx為黑色顆粒，F(xiàn)eO

18、x與Bel7402細胞發(fā)生了較為明顯的吸附，37 nm粒子更易于在細胞表面吸附，表現(xiàn)為每個細胞表面吸附粒子數(shù)量明顯增加。    (a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)2.2  細胞增殖實驗結果    不同粒徑納米FeOx在未經(jīng)磁場照射時并未對細胞增殖產(chǎn)生明顯的影響，細胞經(jīng)SMF照射其增殖在磁場照射初期速度變快，當照射時間超過72 h后增殖未發(fā)生明顯改變(相對對照組)。 經(jīng)EMF照射后兩種粒子吸附細胞的增殖均被抑制，當EMF照射時間為5 h時細胞增殖抑制率達

19、到最大，37nm FeOx抑制率達到（76.31±2.3），70 nm FeOx抑制率為（53.56±5.2）。2.3  細胞凋亡及死亡實驗結果    從表1可見，凋亡率、死亡率3組間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明未經(jīng)磁場照射的納米粒子不能導致細胞死亡及凋亡。表2可見37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射達到60 h后，細胞發(fā)生凋亡，當照射時間為72 h時37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（3.13±0.78），70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率僅為（1.25±0.23）。而未經(jīng)磁場照射37nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.03），70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.02±0.04），未經(jīng)FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.02）