外源DNA和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)

1、外源DNA和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)外源DNA片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3*疑基之間形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸,可生成4個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個(gè)新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個(gè)朵交體分子帶有2個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜本導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。相鄰的5磷酸和3， 羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外山兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實(shí)際上在有克隆用途中,T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接

2、起來(lái)。DNA端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度完全山互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子（分子內(nèi)連接還是位于不同分子（分子間連接，都是如此?，F(xiàn)考慮一種簡(jiǎn)單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA,也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷酸化載體DNAo在瓜作用的底物。如果反應(yīng)中DNA濃度低，則配對(duì)的兩個(gè)末端同一DNA分子的機(jī)會(huì)較大（因?yàn)镈NA分子的一個(gè)末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率。這倦，在DNA濃度低時(shí)，質(zhì)粒DNAfi新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中DNA濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前,某一個(gè)DN

3、A分子的末端碰到另一 DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時(shí)， 連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等（1 975;同時(shí)參見(jiàn)Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷,第2、3期合刊 從理論上探討了DNA濃度對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡(jiǎn)而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個(gè)參數(shù):j和i。j是DNA 分子的一個(gè)末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度,j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的:沉吟液中的DNA呈隨機(jī)卷曲。這樣,j 與DNA分子的長(zhǎng)度成反比（因?yàn)镈NA越長(zhǎng)，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用，因此j對(duì)給定長(zhǎng)度的DNA分

4、子來(lái)說(shuō)是一個(gè)常數(shù)，與DNA深度無(wú)關(guān)。j =3/（37dbO3/2其中1是DNA長(zhǎng)度，以cm計(jì),b是隨機(jī)卷曲的DNA區(qū)段的長(zhǎng)度。b 的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移,而后者可影響DNA的剛度。i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測(cè)量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言,i=2NoMxlO-3末端/ml這里N o是阿佛伽德羅常數(shù),M是DNA的摩爾濃度彈位:mol/L。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定DNA分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中,環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng)j>i時(shí)，有利于重新環(huán)化;當(dāng)i>j，則有利

5、于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了DNA區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需DNA濃度之間關(guān)系（D ugaiczyk等，1985。現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物:其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應(yīng)中末端的絕對(duì)濃度影響, 而且還受質(zhì)粒和外源DNA末端的相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的2-3倍（即末端的絕對(duì)濃度足以滿足分子間連接的要求，而乂不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí)外源DNA末端濃度的2倍時(shí)，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到最大。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40%都 是山單體質(zhì)粒與外源DNA所形

6、成的嵌合體。當(dāng)連接混合物中線嫁質(zhì)粒的量恒定（j:i=3而帶匹配末端的 外源DNA的量遞增時(shí),這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量。涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒DNA的連接反應(yīng)應(yīng)包含：1足量的載體DNA,以滿足j:i>l和j:i<3o對(duì)一個(gè)職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體DNA為20-60ng/mL2未端濃度等于或稍高于載體DNA的外源DNA,如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來(lái)減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質(zhì)粒DNA或發(fā)跡克隆策略以便通過(guò)定向克隆的方法構(gòu)建

7、遼組質(zhì)粒。（二粘端連接1用適當(dāng)?shù)南拗泼赶|(zhì)粒和外源DNAo如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒DNAo通過(guò)酚:氯仿抽提和乙沉淀來(lái)純化DNA撚后用TE（pH7.6溶液使其濃度為100/mlo 2按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物：a .將O.lpl載體DNA轉(zhuǎn)移到無(wú)菌微量離心管中，加等摩爾量的外源DNAob .加水至7.5卩1,于45°C加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到0°C。.加入:10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液lplT4噬菌體NDA連接酶0.1 Weiss單位5minol/L ATP 1 pl于16°C溫育1-4小時(shí)10xT4

8、噬菌體DNA連接酶緩沖液200mmol/L同 Tris.Cl（pH7.650mmol/K MgC1250mmol/L二硫蘇糖醇500|.ig/nil牛血清白蛋白（組分V .Sigma產(chǎn)品（可用可不用該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份,貯存于20°C。另外,再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)，其中含有（1只有質(zhì)粒載體;（2只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒DNA,并盡可能多加外源DNA,同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過(guò)10Mlo可用至少3種不同方法來(lái)測(cè)定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商（除N ew England Biolabs公司外現(xiàn)在都用Weiss等,11968

9、 對(duì)該酶進(jìn)行標(biāo)化。1個(gè)Weiss單位是指在37°C下20分釧內(nèi)催化lmmol32P從焦磷酸根置換到y(tǒng),p-32PATP所需酶時(shí)，1個(gè)Weiss單位相當(dāng)于 0.2個(gè)用外切核酸酶耐受試驗(yàn)來(lái)定義的單位（Modrich和Lehman,1970或者60個(gè)粘端單位（如N ew England Bi olabs公司所定義。因此,0.015W eiss 單位的T4噬菌體DNA連接酶在16°C下30分鐘內(nèi)可使50%的入噬菌體Hind III片段（5pg得以連接。在本書中,T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss 單位表示。par 口前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液（1-5單位/卩1,可

10、用20mmol/L Tris.Cl（pH7.6、60m mol/L KC1 . 5mmol/L二硫蘇糖醇、 500卩g/ml牛血清口蛋口、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的T4噬體DNA連接酶于-20°C保存3個(gè)月可保持穩(wěn)定。3每個(gè)樣品各取1-2卩1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。（三平端DNA連接T4噬菌體DNA連接酶不同于大腸桿菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接（Sgara mella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich, 1978 , 由于DNA很容易成為平端,所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性，

11、才能使任何DNA分子彼此相連。然而，相對(duì)而言,平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下4個(gè)條件：1 低濃度（0.5mmol/L的 ATP（Ferretti和 Sgaranekka, 1981 o2不存在亞精胺一類的多胺。3極高濃度的連接酶（50Weiss單位.ml。4高濃度的平端。1 凝聚劑在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致DNA分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman, 1983;Zimmerman 和 Pheiffer, 1983;ZimmermanT H arrison,1985 或氯化六氨全高鉆（Rusche 和 Howard-Flanders, 1

12、985 , 可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：1它們可使平端DNA的連接速率加大1-3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶DNA濃度不高的條件下進(jìn)行。2它們可以改變連接產(chǎn)物的分布,分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化d：i=10的DNA濃度下，所有的DNA產(chǎn)物也將是線狀多聚體。pai在設(shè)立含凝聚劑的連接反應(yīng)時(shí),下列資料可供參考。(1 聚乙二醇(PEG80001用去離子水配制的PEG 8000貯存液（40%分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。在含15%PEG 8000

13、的連接反應(yīng)混合物中，對(duì)連接反刺激效應(yīng)最為顯著。除P EG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應(yīng)于0°C混合， 然后加適當(dāng)體積的P EG 8000（處于室溫，混勻，加酶后于20°C進(jìn)行溫育。2連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgC12時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)最為顯著，棋至ATP濃度略有增加或MgC12濃度略有降低，都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度（Pheiffer和Zimmerman. 1983o 3濃度為15%的PEG8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來(lái)的10-100倍仮應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。4 PEG 8000可刺激短至8個(gè)核昔酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鉆有所不同。（2氯化六氨合高鉆1氯化六氨合高鉆可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20°C，它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴性。當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為1.0-1.5屮nol/L時(shí),其