工業(yè)微生物育種誘變劑課件

1、工業(yè)微生物育種誘變劑第五章第五章 工業(yè)微生物育種誘變劑工業(yè)微生物育種誘變劑本章內(nèi)容：本章內(nèi)容：化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑物理誘變劑物理誘變劑生物誘變劑生物誘變劑工業(yè)微生物育種誘變劑2 誘變誘變：通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微：通過人為的方法，利用物理、化學(xué)因素處理微生物以引起突變，這一過程稱為生物以引起突變，這一過程稱為誘發(fā)突變誘發(fā)突變。工業(yè)微生物育種誘變劑工業(yè)微生物育種誘變劑4 工業(yè)微生物育種誘變劑5 工業(yè)微生物育種誘變劑6 在在DNADNA復(fù)制過程中取代正常堿基，整合進(jìn)復(fù)制過程中取代正常堿基，整合進(jìn)DNADNA分子分子 它們產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，出現(xiàn)堿基錯(cuò)配它們產(chǎn)生異構(gòu)體的頻率高，出現(xiàn)堿

2、基錯(cuò)配的概率也高的概率也高堿基類似物是如何提高突變頻率的堿基類似物是如何提高突變頻率的? ? 工業(yè)微生物育種誘變劑（一）堿基類似物的誘變機(jī)制（一）堿基類似物的誘變機(jī)制現(xiàn)以現(xiàn)以5-BU為例來分析堿基類似物的誘變機(jī)制。當(dāng)胸為例來分析堿基類似物的誘變機(jī)制。當(dāng)胸腺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中腺嘧啶分子結(jié)構(gòu)中5位碳原子上的甲基被溴（位碳原子上的甲基被溴（Br）原子?。┰尤〈?，就構(gòu)成了代，就構(gòu)成了5-BU的結(jié)構(gòu)式。的結(jié)構(gòu)式。 5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）的結(jié)構(gòu)）的結(jié)構(gòu)工業(yè)微生物育種誘變劑8 5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）的堿基配對(duì)）的堿基配對(duì)工業(yè)微生物育種誘變劑9 A A G G T BUK BUE C 酮

3、式 烯醇式工業(yè)微生物育種誘變劑10 G CG BUeG CG BUeG CA=TA=BUk A:TA: BUk A:TG BUeA:TG CG BUe G CA=T5-BU摻入錯(cuò)誤摻入錯(cuò)誤A: T G C工業(yè)微生物育種誘變劑由于由于5-BU5-BU的誘變作用是在的誘變作用是在DNADNA復(fù)制過程中實(shí)現(xiàn)的，因復(fù)制過程中實(shí)現(xiàn)的，因此，處在靜止或休眠狀態(tài)的細(xì)胞是不適合的。此，處在靜止或休眠狀態(tài)的細(xì)胞是不適合的。細(xì)菌采用對(duì)數(shù)期的細(xì)菌，霉菌、放線菌采用孢子，但細(xì)菌采用對(duì)數(shù)期的細(xì)菌，霉菌、放線菌采用孢子，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動(dòng)狀態(tài)，并要加大要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動(dòng)狀態(tài)，并要加大5-BU5-BU

4、的濃度，處理過程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。的濃度，處理過程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。工業(yè)微生物育種誘變劑12 工業(yè)微生物育種誘變劑13 A 2AP 2AP* GT T C C工業(yè)微生物育種誘變劑（二）堿基類似物的誘變處理方法（以（二）堿基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）為例）5-BU是白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。誘變處理方法如下：是白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。誘變處理方法如下：1.單獨(dú)處理單獨(dú)處理新鮮斜面的細(xì)菌新鮮斜面的細(xì)菌轉(zhuǎn)接到前培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接到前培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期到對(duì)數(shù)期離心除去培養(yǎng)液離心除去培養(yǎng)液加入生理鹽水或緩沖液加入生理鹽水或緩沖液饑餓培養(yǎng)饑餓培養(yǎng)810小時(shí)小時(shí)加入加入

5、5-BU到培養(yǎng)液中，使最后的到培養(yǎng)液中，使最后的處理濃度為處理濃度為2540g/ml,混合均勻混合均勻取取0.10.2ml菌懸液菌懸液加入到瓊脂平板上涂布培養(yǎng)加入到瓊脂平板上涂布培養(yǎng)在適宜溫度下，使之在生長(zhǎng)在適宜溫度下，使之在生長(zhǎng)過程中誘變處理過程中誘變處理培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行篩選。培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行篩選。工業(yè)微生物育種誘變劑真菌、放線菌孢子，則要提高真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度（的濃度（0.11mg/ml），），加到孢子懸液后，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)加到孢子懸液后，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)(一般一般612h)分離分離于平皿于平皿適溫培養(yǎng)適溫培養(yǎng)挑取單菌落，進(jìn)行篩選。挑取單菌落，進(jìn)行篩

6、選。2.與輻射線復(fù)合處理與輻射線復(fù)合處理 據(jù)報(bào)道，如果菌體先用據(jù)報(bào)道，如果菌體先用5-BU等堿基類似物進(jìn)行處理，等堿基類似物進(jìn)行處理，使它們首先滲入到使它們首先滲入到DNA分子中，然后用輻射線照射，誘變分子中，然后用輻射線照射，誘變效果會(huì)比單獨(dú)使用輻射線更好。因此，堿基類似物也是一效果會(huì)比單獨(dú)使用輻射線更好。因此，堿基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑。種輻射誘變的增敏劑。工業(yè)微生物育種誘變劑16 （a a）亞硝酸（）亞硝酸（b b）羥胺（）羥胺（c c）甲基磺酸乙酯（）甲基磺酸乙酯（d d）N-N-甲基甲基-N-N-硝基硝基-N-N-亞硝基胍亞硝基胍 工業(yè)微生物育種誘變劑17 工業(yè)微生物育種誘變

7、劑NoImageNoImage18 亞硝酸的脫氨基作用及其誘發(fā)的突變亞硝酸的脫氨基作用及其誘發(fā)的突變 工業(yè)微生物育種誘變劑19 HNO2 A H G G A A T C C C U T HNO2 A:T GC工業(yè)微生物育種誘變劑 亞硝酸的處理方法亞硝酸的處理方法 試劑的配制試劑的配制（1）1mol/LpH4.5醋酸緩沖液醋酸緩沖液（2）0.1mol/L亞硝酸鈉溶液亞硝酸鈉溶液（3）0.07mol/LpH8.6磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉溶液2.處理方法（以處理濃度處理方法（以處理濃度0.025mol/L為例）為例） 取孢子懸液取孢子懸液1ml，pH4.5醋酸緩沖液醋酸緩沖液2ml及及0.1mol/

8、L亞硝酸鈉溶亞硝酸鈉溶液液1ml，最后處理濃度為，最后處理濃度為0.025mol/L。于。于2526保溫保溫1020min，加入，加入0.07mol/L、pH8.6的磷酸氫二鈉溶液的磷酸氫二鈉溶液20ml，使，使pH下降至下降至6.8左右，以終止反應(yīng)。稀釋分離于平板。左右，以終止反應(yīng)。稀釋分離于平板。工業(yè)微生物育種誘變劑 如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol/L為例：為例：將將斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，將培養(yǎng)斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)基，適溫培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄去上清液，用生理鹽水洗滌。液進(jìn)行離心，棄去上清液，用生理鹽水

9、洗滌。pH4.5醋酸緩醋酸緩沖液和沖液和0.1mol/L硝酸鈉溶液硝酸鈉溶液1:1濃度加入沉淀的菌體中，使?jié)舛燃尤氤恋淼木w中，使之懸浮。于之懸浮。于3537處理處理510min、加入、加入5倍的倍的pH8.6的磷的磷酸氫二鈉溶液，使酸氫二鈉溶液，使pH下降到下降到6.8。取一定量進(jìn)行后培養(yǎng)。取一定量進(jìn)行后培養(yǎng)1.52h。然后稀釋分離于平板上。然后稀釋分離于平板上。注：在亞硝酸處理菌體或孢子時(shí)要嚴(yán)格控制好溫度，注：在亞硝酸處理菌體或孢子時(shí)要嚴(yán)格控制好溫度，否則會(huì)影響誘變效果。否則會(huì)影響誘變效果。工業(yè)微生物育種誘變劑NoImageNoImage22 工業(yè)微生物育種誘變劑羥胺的誘變機(jī)制羥胺的誘變機(jī)

10、制改變了結(jié)構(gòu)的改變了結(jié)構(gòu)的胞嘧啶胞嘧啶工業(yè)微生物育種誘變劑 根據(jù)誘變機(jī)制，羥胺不能使突變回復(fù)，即不能使根據(jù)誘變機(jī)制，羥胺不能使突變回復(fù)，即不能使A:T G:C轉(zhuǎn)換，進(jìn)行逆向突變。轉(zhuǎn)換，進(jìn)行逆向突變。 由于羥胺是誘發(fā)由于羥胺是誘發(fā)G:C A:T的專一性誘變劑，因的專一性誘變劑，因此，可以用來鑒別突變體是此，可以用來鑒別突變體是A:T G:C還是還是G:C A:T轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換。 羥胺的處理方法：羥胺的處理方法：常用濃度為常用濃度為0.15%，可直接，可直接在溶液中處理，時(shí)間在溶液中處理，時(shí)間12h，然后分離培養(yǎng)。但一般，然后分離培養(yǎng)。但一般都加到瓊脂平板或振蕩培養(yǎng)基中，然后接入孢子或都加到瓊脂平板或

11、振蕩培養(yǎng)基中，然后接入孢子或細(xì)菌，在適溫下培養(yǎng)，生長(zhǎng)過程中處理，所用濃度細(xì)菌，在適溫下培養(yǎng)，生長(zhǎng)過程中處理，所用濃度比直接處理時(shí)低些。比直接處理時(shí)低些。工業(yè)微生物育種誘變劑烷化劑是誘發(fā)突變中一類相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，烷化劑是誘發(fā)突變中一類相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，這類誘變劑具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，它們易取代這類誘變劑具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個(gè)或多個(gè)堿基起烷化反分子中活潑的氫原子，直接與一個(gè)或多個(gè)堿基起烷化反應(yīng)，從而改變應(yīng)，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。分子結(jié)構(gòu)，引起突變。雙功能烷化劑雙功能烷化劑單功能烷化劑單功能烷化劑多功能烷化劑多功能烷化劑根據(jù)烷化

12、劑中活性根據(jù)烷化劑中活性烷基的數(shù)目烷基的數(shù)目亞硝基類、磺酸酯類、硫酸酯類、亞硝基類、磺酸酯類、硫酸酯類、重氮烷類、乙烯亞胺類化合物重氮烷類、乙烯亞胺類化合物硫芥子、氮芥子類等硫芥子、氮芥子類等工業(yè)微生物育種誘變劑26 烷化堿基部分烷化劑部分烷化劑部分烷化劑 和和 烷化堿基烷化堿基 甲基磺酸甲酯甲基磺酸甲酯亞硝基乙基脲亞硝基乙基脲7-甲基鳥嘌呤甲基鳥嘌呤3-甲基腺嘌呤甲基腺嘌呤O6-甲基鳥嘌呤甲基鳥嘌呤工業(yè)微生物育種誘變劑 烷化劑的誘變機(jī)制烷化劑的誘變機(jī)制烷化劑主要使通過烷化基團(tuán)使烷化劑主要使通過烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸分子上的堿基及磷酸部分烷化，部分烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤

13、而引起突變。復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。 堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤N N7 7是最易是最易起反應(yīng)的位點(diǎn)，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；甲基磺酸起反應(yīng)的位點(diǎn)，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；甲基磺酸乙酯主要使嘌呤乙酯主要使嘌呤N N7 7烷基化。烷基化。 工業(yè)微生物育種誘變劑 其次引起烷化的位點(diǎn)是鳥嘌呤其次引起烷化的位點(diǎn)是鳥嘌呤N N3 3、腺嘌呤、腺嘌呤N N2 2、腺嘌、腺嘌呤呤N N7 7和胞嘧啶和胞嘧啶N N3 3。這些位點(diǎn)引起堿基置換的僅占烷化。這些位點(diǎn)引起堿基置換的僅占烷化作用的作用的10%10%左右。因此，由這

14、些位點(diǎn)改變所引起的突變左右。因此，由這些位點(diǎn)改變所引起的突變僅是少數(shù)。僅是少數(shù)。 此外，此外，DNADNA分子中比較多的烷化位點(diǎn)是鳥嘌呤分子中比較多的烷化位點(diǎn)是鳥嘌呤O O6 6、胸腺嘧啶胸腺嘧啶O O4 4，這些可能都是引起突變的主要位點(diǎn)。，這些可能都是引起突變的主要位點(diǎn)。 工業(yè)微生物育種誘變劑 如果鳥嘌呤如果鳥嘌呤N7等位點(diǎn)被烷化后，它和核糖結(jié)合鍵發(fā)生水解等位點(diǎn)被烷化后，它和核糖結(jié)合鍵發(fā)生水解反應(yīng)，引起鳥嘌呤從反應(yīng)，引起鳥嘌呤從DNA分子上脫落下來，使分子上脫落下來，使DNA鏈上堿基空鏈上堿基空缺，在以后的復(fù)制過程中其它游離堿基有可能錯(cuò)誤摻入。缺，在以后的復(fù)制過程中其它游離堿基有可能錯(cuò)誤摻

15、入。GCGC就可能變?yōu)槿魏螇A基對(duì)就可能變?yōu)槿魏螇A基對(duì) G:CA:T轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)換及G:CC: G或或G:CT: A 顛換而導(dǎo)致顛換而導(dǎo)致突變。突變。 工業(yè)微生物育種誘變劑 由于烷基化后的鳥嘌呤，易離子化，由原來的酮式變?yōu)橛捎谕榛蟮镍B嘌呤，易離子化，由原來的酮式變?yōu)椴环€(wěn)定的烯醇式，不能和胞嘧啶配對(duì)，而是與胸腺嘧啶錯(cuò)誤不穩(wěn)定的烯醇式，不能和胞嘧啶配對(duì)，而是與胸腺嘧啶錯(cuò)誤配對(duì)，結(jié)果發(fā)生配對(duì)，結(jié)果發(fā)生G:CA:T轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致突變。轉(zhuǎn)換而導(dǎo)致突變。 工業(yè)微生物育種誘變劑 烷化鳥嘌呤的堿基配對(duì)烷化鳥嘌呤的堿基配對(duì) 工業(yè)微生物育種誘變劑 烷化劑除了以上誘變作用之外，還有可能使兩個(gè)鳥嘌呤烷化劑除了以上誘變作用之

16、外，還有可能使兩個(gè)鳥嘌呤N N7 7位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，一般雙功能烷化劑容易引起位點(diǎn)形成共價(jià)鍵，一般雙功能烷化劑容易引起DNADNA雙鏈間的雙鏈間的交聯(lián)，造成變異或死亡。交聯(lián)，造成變異或死亡。 工業(yè)微生物育種誘變劑33 總結(jié)鳥嘌呤總結(jié)鳥嘌呤N7位點(diǎn)的位點(diǎn)的烷化作用烷化作用工業(yè)微生物育種誘變劑 烷化劑的性質(zhì)烷化劑的性質(zhì) 烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生水解。生水解。它們大部分半衰期很短，其長(zhǎng)度與溫度、溶液它們大部分半衰期很短，其長(zhǎng)度與溫度、溶液pH關(guān)系關(guān)系很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。不少烷化劑見

17、光后，容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，和水解作用不少烷化劑見光后，容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，和水解作用一樣，有的分解產(chǎn)物會(huì)失去誘變作用或具毒性。因此，保藏一樣，有的分解產(chǎn)物會(huì)失去誘變作用或具毒性。因此，保藏時(shí)要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。時(shí)要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。另外，配制烷化劑溶液時(shí)，要采用合適的另外，配制烷化劑溶液時(shí)，要采用合適的pH緩沖液。緩沖液。 工業(yè)微生物育種誘變劑烷化劑名稱烷化劑名稱理化特性理化特性pH7pH7水中半衰期水中半衰期/h/h分子分子量量狀態(tài)狀態(tài)水溶性水溶性溶點(diǎn)或沸點(diǎn)溶點(diǎn)或沸點(diǎn)202030303737甲基磺酸乙酯甲基磺酸乙酯(EMS)(EMS)無

18、色液體無色液體約約8%8%沸點(diǎn)沸點(diǎn)8586/10mmH8586/10mmHg g9393262610.410.4124124乙烯亞胺乙烯亞胺(EI)(EI)無色液體無色液體易溶于水易溶于水沸點(diǎn)沸點(diǎn)56/760mmHg56/760mmHg4343亞硝基乙基脲亞硝基乙基脲(NEU)(NEU)粉紅色液粉紅色液約約5%5%沸點(diǎn)沸點(diǎn)53/5mmHg53/5mmHg8484117117亞硝基甲基脲亞硝基甲基脲(NMU)(NMU)黃色固體黃色固體3535103103硫酸二乙酯硫酸二乙酯(DES)(DES)無色油狀無色油狀物物不易溶不易溶3.343.341 10.50.5亞硝基胍亞硝基胍(NTG)(NTG)黃

19、色固體黃色固體熔點(diǎn)熔點(diǎn)118118烷化劑的某些性質(zhì)烷化劑的某些性質(zhì)工業(yè)微生物育種誘變劑 幾種常用的烷化劑：幾種常用的烷化劑： 1-1-甲基甲基-3-3-硝基硝基-1-1-亞硝基胍（簡(jiǎn)稱亞硝基胍，亞硝基胍（簡(jiǎn)稱亞硝基胍，NTGNTG或或NGNG或或MNNGMNNG） 為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)降低。須保存在棕色瓶中，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)降低。須保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低溫條件下貯存。并在避光、干燥、低溫條件下貯存。 NTG不溶于水，須加助溶劑，使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。不溶于水，須加助溶劑，

20、使用時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用。 NTG NTG有超誘變劑之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效有超誘變劑之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。其中處理細(xì)菌、放線果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。其中處理細(xì)菌、放線菌等微生物時(shí)，不經(jīng)淘汰，就可以直接得到菌等微生物時(shí)，不經(jīng)淘汰，就可以直接得到10%10%以上的營養(yǎng)缺陷以上的營養(yǎng)缺陷型突變株。而用一般誘變劑處理只能達(dá)百分之幾至千分之幾。型突變株。而用一般誘變劑處理只能達(dá)百分之幾至千分之幾。 工業(yè)微生物育種誘變劑 NTG NTG的水溶液中隨著不同的的水溶液中隨著不同的pHpH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，

21、從而影響誘變效應(yīng)。而影響誘變效應(yīng)。當(dāng)溶液當(dāng)溶液pHpH低于低于5.55.5時(shí)，時(shí)，NTGNTG分解成分解成HNO2, HNO2HNO2, HNO2本身就具誘變本身就具誘變作用；作用；當(dāng)溶液當(dāng)溶液pHpH在在8.08.0以上時(shí)，以上時(shí)，NTGNTG會(huì)分解產(chǎn)生重氮甲烷會(huì)分解產(chǎn)生重氮甲烷（CH2N2CH2N2），對(duì)核酸起烷化作用，引起微生物突變；），對(duì)核酸起烷化作用，引起微生物突變；當(dāng)溶液當(dāng)溶液pHpH為為6.06.0時(shí)，時(shí)，NTGNTG本身和本身和DNADNA起烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。起烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。通常在通常在pH6.0pH6.0的條件下進(jìn)行誘變處理。由于酸堿條件影響的條件下進(jìn)行誘變處理。由于

22、酸堿條件影響NTGNTG的誘變效果，因此，無論是配制的誘變效果，因此，無論是配制NTGNTG溶液，還是制備均懸液都溶液，還是制備均懸液都要用適宜的緩沖溶液。常用的由磷酸緩沖液和要用適宜的緩沖溶液。常用的由磷酸緩沖液和TrisTris緩沖液緩沖液. . 工業(yè)微生物育種誘變劑1.1.取新鮮的斜面，用一定取新鮮的斜面，用一定pHpH值的緩沖液或值的緩沖液或TrisTris緩沖液洗緩沖液洗下細(xì)菌制成菌懸液。下細(xì)菌制成菌懸液。如果采用細(xì)菌細(xì)胞或絲狀菌孢子如果采用細(xì)菌細(xì)胞或絲狀菌孢子（真菌或放線菌）須進(jìn)行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替（真菌或放線菌）須進(jìn)行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時(shí)間控制

23、在大部分孢子處在萌動(dòng)以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時(shí)間控制在大部分孢子處在萌動(dòng)階段，經(jīng)離心、洗滌，用緩沖液制成懸液，濃度約在階段，經(jīng)離心、洗滌，用緩沖液制成懸液，濃度約在10106 6-10-107 7ml-1ml-1；NTGNTG的誘變處理方法：的誘變處理方法：工業(yè)微生物育種誘變劑2.2.配制配制NTGNTG母液：母液： 由于由于NTGNTG不溶于水，配制需加助溶劑甲不溶于水，配制需加助溶劑甲酰胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為酰胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為9 9：1 1（緩（緩沖溶液沖溶液9ml9ml：NTGNTG丙酮溶液丙酮溶液1ml1ml），一般），一般NTGNTG母液濃度配成母液

24、濃度配成1mg/ml1mg/ml。使用時(shí)取母液。使用時(shí)取母液0.2ml0.2ml，加菌懸液，加菌懸液1.8ml1.8ml，NTGNTG最后最后處理濃度為處理濃度為100g/ml100g/ml。一般處理濃度隨菌種不同而異，一般處理濃度隨菌種不同而異，通常細(xì)菌為通常細(xì)菌為1001000g/ml1001000g/ml，而放線菌、真菌孢子為，而放線菌、真菌孢子為10003000 g/ml 10003000 g/ml 。3.3.將以上菌懸液和將以上菌懸液和NTGNTG溶液混合于一試管內(nèi)，置該菌生長(zhǎng)溶液混合于一試管內(nèi)，置該菌生長(zhǎng)適宜的溫度下保溫處理若干時(shí)間。適宜的溫度下保溫處理若干時(shí)間。工業(yè)微生物育種誘變

25、劑4.4.終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。用冷的生理鹽水稀釋到用冷的生理鹽水稀釋到5050倍以上或在低溫倍以上或在低溫下進(jìn)行離心洗滌，除去藥液，加無菌水使沉淀懸浮并作下進(jìn)行離心洗滌，除去藥液，加無菌水使沉淀懸浮并作成一定稀釋度分離于平皿。成一定稀釋度分離于平皿。處理完畢后，馬上把接觸過處理完畢后，馬上把接觸過NTGNTG的器皿用的器皿用NaOHNaOH或或NaNa2 2S S2 2O O3 3浸浸泡處理。泡處理。除以上直接以溶液處理外，也可以進(jìn)行如下方法誘變處理：除以上直接以溶液處理外，也可以進(jìn)行如下方法誘變處理：1.1.搖瓶振蕩處理搖瓶振蕩處理2.2.在平皿上生長(zhǎng)過程處理在平皿上生長(zhǎng)過程處理工業(yè)微生物育

26、種誘變劑NTGNTG是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過NTGNTG的器皿必須及時(shí)、的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理，例如用自來水大量沖洗或用單獨(dú)處理，例如用自來水大量沖洗或用112mol/L2mol/L的的NaOHNaOH或或2%2%的的Na2S2O3Na2S2O3浸泡過夜，洗凈。浸泡過夜，洗凈。工業(yè)微生物育種誘變劑42 G O-6-E-G A T O-4-E-T C C T T A G G工業(yè)微生物育種誘變劑43 溴化乙錠（EtBr

27、）由美國的腫瘤研究所合成，故名。這是一些由由美國的腫瘤研究所合成，故名。這是一些由烷化劑與吖啶類化合物相結(jié)合的化合物。烷化劑與吖啶類化合物相結(jié)合的化合物。工業(yè)微生物育種誘變劑44 B嵌入到舊鏈上嵌入到舊鏈上導(dǎo)致插入突變導(dǎo)致插入突變A嵌入到新嵌入到新合成鏈上導(dǎo)合成鏈上導(dǎo)致缺失突變致缺失突變工業(yè)微生物育種誘變劑 移碼誘變劑的嵌入并不導(dǎo)致突變，必須通過移碼誘變劑的嵌入并不導(dǎo)致突變，必須通過DNADNA的復(fù)制才的復(fù)制才形成突變，因此這類誘變劑只能作用于生長(zhǎng)態(tài)的細(xì)胞。形成突變，因此這類誘變劑只能作用于生長(zhǎng)態(tài)的細(xì)胞。 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用溴化乙錠能嵌入到分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用溴化乙錠能嵌入到DNADNA

28、分子的特分子的特性，將其作為常用的性，將其作為常用的DNADNA染料；染料； 在微生物遺傳育種中溴化乙錠是酵母菌小菌落突變型的有在微生物遺傳育種中溴化乙錠是酵母菌小菌落突變型的有效誘變劑。效誘變劑。工業(yè)微生物育種誘變劑46 工業(yè)微生物育種誘變劑 重視化學(xué)誘變劑的操作安全重視化學(xué)誘變劑的操作安全 化學(xué)誘變劑多數(shù)是極毒的致癌藥品，在進(jìn)行誘變操作化學(xué)誘變劑多數(shù)是極毒的致癌藥品，在進(jìn)行誘變操作后的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護(hù)都是及其重后的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護(hù)都是及其重要的。如有疏忽，就可能對(duì)人體健康的環(huán)境帶來惡果，萬要的。如有疏忽，就可能對(duì)人體健康的環(huán)境帶來惡果，萬萬不可麻痹。

29、萬不可麻痹。使用化學(xué)誘變劑一般要求避光、密封、低溫、干燥等；使用化學(xué)誘變劑一般要求避光、密封、低溫、干燥等；盡可能不觸及人體任何部位；盡可能不觸及人體任何部位；對(duì)殘余物要及時(shí)進(jìn)行消毒、稀釋處理。對(duì)殘余物要及時(shí)進(jìn)行消毒、稀釋處理。工業(yè)微生物育種誘變劑48 物理誘變劑是指通常使用物理輻射中的各種射物理誘變劑是指通常使用物理輻射中的各種射線，包括紫外線、線，包括紫外線、X X射線、射線、射線、快中子、射線、快中子、射射線、線、射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。宇宙線等。工業(yè)微生物育種誘變劑工業(yè)微生物育種誘變劑50 工業(yè)微生物育種誘變劑NoImage

30、NoImage51 O O UV O O H CH3 H CH3 H CH3 CH3 H N N N N O N H O N H O N H H N O Thymine Thymine Thymine dimer O O 4 5 4 5 3 6 6 2 1 Fig. 21- Production of thymine dimer by ultraviolet light irradiation. 工業(yè)微生物育種誘變劑52 工業(yè)微生物育種誘變劑53 工業(yè)微生物育種誘變劑54 工業(yè)微生物育種誘變劑55 工業(yè)微生物育種誘變劑56 工業(yè)微生物育種誘變劑57 工業(yè)微生物育種誘變劑58 工業(yè)微生物育種誘變劑59 誘變劑誘變劑 在在DNADNA上的初級(jí)效應(yīng)上的初級(jí)效應(yīng) 遺傳反應(yīng)遺傳反應(yīng) 堿基類似物堿基類似物 摻入作用摻入作用 ATATGCGC轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 羥胺羥胺 同胞嘧啶起羥化反應(yīng)同胞嘧啶起羥化反應(yīng) GCATGCAT轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換 亞硝酸亞硝酸 A A、C C的脫氧基作用的脫氧基作用 DNA