基于徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的斯普林注射液紫外光譜定量分析

1、基于徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的斯普林注射液紫外光譜定量分析 作者：李辰 劉鶴松 孟慶繁 郭偉良 滕樂生 滕利榮【摘要】 目的建立了一種無損的、可在線快速測(cè)定斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。方法采用光譜儀掃描不同批次的斯普林注射液樣品的紫外光譜，然后采用經(jīng)典的分析方法測(cè)定對(duì)應(yīng)樣品中核糖和多肽的含量，應(yīng)用徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（RBFNN）建立了斯普林注射液樣品的紫外光譜與其中核糖和多肽含量間的定量關(guān)系模型。通過選擇最有效的光譜預(yù)處理方法、網(wǎng)絡(luò)的最優(yōu)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)參數(shù)和最佳擴(kuò)展常數(shù)對(duì)模型進(jìn)行最優(yōu)化。結(jié)果應(yīng)用最優(yōu)模型對(duì)斯普林注射液預(yù)測(cè)集樣品中核糖和多肽含量，預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）分別為0.013 2和0.013

2、 8。結(jié)論 紫外光譜方法測(cè)定斯普林注射液中核糖和多肽含量，預(yù)測(cè)精度高，方法簡(jiǎn)便可行，且多組分可同時(shí)測(cè)定，為測(cè)定中藥組分含量提供了一條新途徑。 【關(guān)鍵詞】 紫外光譜 徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) 斯普林注射液斯普林注射液（小牛脾提取物注射液）是用于提高機(jī)體免疫力的藥物。從健康小牛健康脾臟中提取的高活性的分子多肽物能刺激骨髓肝細(xì)胞增殖，升高外周血白細(xì)胞，促進(jìn)造血功能的恢復(fù)，有效地緩解化療藥物所導(dǎo)致的血細(xì)胞減少、出血等副作用，而且能激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，明顯地減輕患者疼痛，有效緩解化療所導(dǎo)致的惡心、嘔吐，恢復(fù)患者體力，改善睡眠，穩(wěn)定情緒，增加食欲，提高患者生活質(zhì)量1。李霞等2對(duì)貴州少數(shù)民族地區(qū)的住院治療的88例晚期腫

3、瘤病人進(jìn)行了斯普林與參麥注射液對(duì)照治療觀察，結(jié)果顯示斯普林對(duì)晚期癌癥病人全身狀況改善方面有較好的輔助治療。斯普林注射液主要有效成分為核糖和多肽，而這些主成分常規(guī)分析方法主要為Folin酚法、高效液相色譜法3、凱氏定氮法4，分光光度法5等，這些方法均需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，需要很多有機(jī)試劑，操作繁瑣，本文采用紫外光譜結(jié)合徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)6（RBFNN）建立快速無損定量分析斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。 1 器材 1.1 儀器 紫外可見近紅外分光光度計(jì)（UV-3150，日本島津公司）。 1.2 試劑與材料 斯普林注射液（吉林馬應(yīng)龍制藥有限公司，中國(guó)）；D-核糖；三氯醋酸；牛血清白蛋白。 2 方

4、法與結(jié)果 2.1 紫外光譜的采集 采用紫外可見近紅外分光光度計(jì)對(duì)不同批次的斯普林注射液40個(gè)樣品進(jìn)行紫外光譜掃描，光譜波長(zhǎng)范圍設(shè)為200400 nm，光譜通帶寬度設(shè)置為2 nm，每個(gè)樣品掃描3次，取平均光譜作為該樣品的光譜。斯普林注射液紫外光譜如圖 1，本文采用RBFNN建立斯普林注射液樣品紫外光譜與其中的核糖和多肽含量間的定量分析模型，應(yīng)用所建立的模型可同時(shí)測(cè)定斯普林注射液樣品中核糖和多肽的含量，該方法具有簡(jiǎn)單、快捷、無污染和無預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。 圖1 斯普林注射液樣品紫外光譜 2.2 核糖含量的測(cè)定 精密稱取D-核糖適量，用5%三氯醋酸溶液溶解制成20 g/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密移取0.5，

5、1.0，1.5，2.0和2.5 ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，用5%三氯醋酸溶液定容至2 ml各加入3，5-二羥基甲苯溶液2.0 ml，搖勻，水浴中準(zhǔn)確加熱30 min，迅速冷卻，于650 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=22.080X-0.008，R20.997。精密移取2 ml供試品液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定不同批次斯普林注射液樣品中核糖含量。表1 各樣品集中核糖和多肽含量的統(tǒng)計(jì) 2.3 多肽含量的測(cè)定 采用Folin酚法測(cè)定斯普林注射液中多肽含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為Y=1.369 9X-0.013 3，R20.996，線性范圍為0.0250.

6、250 mg/ml。 斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量統(tǒng)計(jì)見表1。 2.4 徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定量分析模型的建立采用卷積平滑、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量轉(zhuǎn)換（SNV）分別對(duì)所有斯普林注射液樣品的紫外光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后采用主成分析方法對(duì)原始光譜和預(yù)處理后光譜矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA），根據(jù)第一主成分與第二主成分得分作圖，將樣品分為校正集、預(yù)測(cè)集和驗(yàn)證集樣品，以主成分得分作為RBFNN網(wǎng)絡(luò)的輸入節(jié)點(diǎn)，以“2.2”項(xiàng)和“2.3”項(xiàng)所測(cè)得的核糖和多肽含量為輸出節(jié)點(diǎn)，建立測(cè)定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，為了避免模型出現(xiàn)過擬和，本實(shí)驗(yàn)引進(jìn)逼近度（Da）為模型優(yōu)化參數(shù)，對(duì)模型輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)

7、、隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)和擴(kuò)展常數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，逼近度（Da）的計(jì)算方法如式（1）和（2）： ea=ncnec+nvnev+ec-ev （1） Da=cea（2） 式中ea,ec,ev分別是逼近誤差、校正集均方根誤差（RMSEC）和驗(yàn)證均方根誤差（RMSEV），n, nc, nv,分別為樣品總數(shù)、校正集樣品數(shù)和驗(yàn)證集樣品數(shù)。C是常數(shù)(本文中C取0.000 1)，主要以調(diào)整Da大小方便于作圖，模型的預(yù)測(cè)能力以預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）來評(píng)價(jià)，RMSEC，RMSEV和RMSEP的算法可參考文獻(xiàn)7。百事通 2.5 徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)化 2.5.1 光譜預(yù)處理方法的選擇 分別采用一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、卷積平滑光譜

8、和SNV光譜預(yù)處理方法對(duì)斯普林注射液樣品的原光譜進(jìn)行預(yù)處理，然后應(yīng)用PCA的方法對(duì)原始光譜和各預(yù)處理后的光譜進(jìn)行主成分提取，以主成分得分作為輸入節(jié)點(diǎn)建立測(cè)定斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量的定量分析模型，各光譜所建立的最優(yōu)模型的性能參數(shù)列于（表2），由表 2而可以看出，在測(cè)定核糖含量時(shí)，采用一階導(dǎo)數(shù)光譜所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，同時(shí)它具有最大的Da值，而在測(cè)定多肽含量時(shí)，采用SNV光譜所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，Da值也為最大值，因此確定測(cè)定核糖和多肽含量時(shí)，最有效的光譜預(yù)處理方法分別為一階導(dǎo)數(shù)光譜法和SNV方法。表2 原始光譜及不同預(yù)處理

9、后光譜所建立的測(cè)定核糖和多肽含量最優(yōu)模型的性能參數(shù) 2.5.2 光譜輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)的選擇 采用PCA方法對(duì)光譜進(jìn)行分析，提取光譜前20主成分，分別以前320主成分的得分作為RBFNN的輸入節(jié)點(diǎn)，為了避免模型出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，以逼近度（Da）為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，考察輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)模型性能的影響見圖2，由圖 2可以看出，在測(cè)定核糖合多肽含量時(shí)候，最佳的輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)分別為10和13。 圖2 輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)測(cè)定斯普林注射液中核糖與多肽 含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影響 2.5.3 隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)的選擇 RBFNN是從0個(gè)神經(jīng)元開始訓(xùn)練，通過檢查輸出誤差使網(wǎng)絡(luò)自動(dòng)增加神經(jīng)元，直到誤差達(dá)到要求或是最大隱含

10、層神經(jīng)元數(shù)為止。隱含節(jié)點(diǎn)太少，擬合不充分；隱含節(jié)點(diǎn)增加得過多會(huì)過擬合。所以本文以Da為模型優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)，選出最合適的隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)。圖 3是在最不同隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)Da的影響，由圖 3可以看出測(cè)定核糖和多肽模型的最佳隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)均為19。 圖3 隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)對(duì)測(cè)定斯普林注射液中核糖 與多肽含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影響 2.5.4 擴(kuò)展常數(shù)的選擇 擴(kuò)展常數(shù)的大小關(guān)系到擬合函數(shù)變化的快慢，從而影響模型的擬合程度，以Da為標(biāo)準(zhǔn)，考察擴(kuò)展常數(shù)在0.39范圍內(nèi)對(duì)模型的影響，以選擇合適的擴(kuò)展常數(shù)，結(jié)果如圖 4所示，由圖 4可以看出，在測(cè)定斯普林注射液樣品中的核糖和多肽含量時(shí)模型最適的擴(kuò)展常數(shù)

11、分別為0.6和1.2。 2.6 最優(yōu)模型的建立 采用RBFNN結(jié)合紫外光譜建立測(cè)定斯普林注射液樣品中核糖和多肽含量的定量分析模型，模型經(jīng)過選擇最有效的光譜預(yù)處理方法、最適的輸入節(jié)點(diǎn)數(shù)、隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)和擴(kuò)展常數(shù)，得到最優(yōu)的模型，應(yīng)用最優(yōu)的模型預(yù)測(cè)各樣品集的核糖和多肽含量，預(yù)測(cè)值與化學(xué)測(cè)量值間的相關(guān)性如圖 5，由圖 5可以看出預(yù)測(cè)值與化學(xué)測(cè)量值吻合的很好，說明該方法可行。 2.7 最優(yōu)模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品的預(yù)測(cè) 采用“2.6”項(xiàng)中所建立的最優(yōu)模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品中的核糖和多肽含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）分別為0.013 2和0.013 8，預(yù)測(cè)值和真實(shí)值列于表 3，計(jì)算預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間的絕對(duì)誤差

12、和樣品回收率，由表 3可以看出，核糖含量的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值間絕對(duì)誤差不大于0.023，平均回收率為101.224%，而多肽預(yù)測(cè)值間的絕對(duì)誤差不大于0.033，平均回收率為101.651%，說明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值吻合的比較好，模型預(yù)測(cè)能滿足要求。表3 最優(yōu)模型對(duì)預(yù)測(cè)集樣品中核糖和多肽含量預(yù)測(cè)值與真實(shí)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果 3 討論 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合紫外光譜建立了測(cè)定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，文中引進(jìn)逼近度作為模型優(yōu)化的參數(shù)，可有效地避免模型發(fā)生過擬合現(xiàn)象。模型經(jīng)過優(yōu)化后，對(duì)預(yù)測(cè)集樣品中的多肽和核糖含量進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)均方根誤差（RMSEP）達(dá)到0.0132和0.0138，說明模型具有很

13、高的預(yù)測(cè)精度，可應(yīng)用于斯普林注射液質(zhì)量監(jiān)測(cè)。 本實(shí)驗(yàn)方便快捷，不需有機(jī)試劑，無污染，操作簡(jiǎn)單，并可兩組分同時(shí)檢測(cè)，質(zhì)量準(zhǔn)確，可應(yīng)用于斯普林注射液生產(chǎn)的質(zhì)量檢測(cè)和在線監(jiān)控?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 張吉鳳, 趙 雷, 夏大文. 斯普林對(duì)小鼠免疫功能影響的研究J.中華腫瘤防治雜志, 2005, 12(7)：519.2 李 霞, 張 萍, 杜迎春, 等. 斯普林改善晚期惡性腫瘤全身狀況的療效觀察J.腫瘤, 2005, 25(6)：633.3 張津楓, 王健剛, 鄧國(guó)才, 等. 葡萄糖發(fā)酵液D-核糖含量的高效液相色譜分析J.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2001, 22(1)：43.4 呂偉仙, 葛 瀅, 吳健之, 等. 植物中硝態(tài)氮、氨態(tài)氮、總氮測(cè)定方法的比較研究J.光譜學(xué)與光譜分析, 2004, 24(2)：204.5 陳蓮惠, 劉紹璞, 劉忠芳, 等. 堿性二苯基萘基甲烷染料褪色光度法測(cè)定透明質(zhì)酸鈉J.分析化學(xué), 2004, 32(5)：698.6 毛利鋒, 沈 明, 程翼宇. 毛細(xì)管電泳徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)校正法定量分析核苷J(rèn)