第五章 抗體的制備

1、第五章 抗體的制備 1975年Kohler和Milstein首先報(bào)道用細(xì)胞雜交技術(shù)使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞（SRBC）免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，建立起第一個(gè)細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）。迄今全世界已研制成數(shù)以千的McAb。 單克隆抗體的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)，便于人為處理和質(zhì)量控制，并且來(lái)源容易，所以一問(wèn)世便受到歡迎和重視。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，McAb在診斷疾病、判斷預(yù)后、防治疾病以及疾病機(jī)制研究等方面起著巨大的促進(jìn)作用。為此，兩位發(fā)明者于1984年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理

2、 雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)（選擇原理見(jiàn)后），小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無(wú)限分裂、增殖，即所謂“永生”性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克隆。其原理從下列幾個(gè)主要步驟闡明。 （一）細(xì)胞的選擇與融合 建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對(duì)抗原特異的單克隆抗體，所以融合細(xì)胞一方必須選擇經(jīng)過(guò)抗原免疫的細(xì)胞，通常來(lái)源于免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞。脾是細(xì)胞聚集的

3、重要場(chǎng)所，無(wú)論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會(huì)出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細(xì)胞的另一方則是為了保持細(xì)胞融合后細(xì)胞的不斷增殖，只有腫瘤細(xì)胞才具備這種特性。選擇同一體系的細(xì)胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是細(xì)胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細(xì)胞融合伴侶。目前常用的細(xì)胞瘤株有：P3-X63-Ag8（Kohlerand Milstein,1975）,P3-NSI/1-Ag4-1（Kohler and Milstein,1976），X63-Ag8.653（Kearney et al,1979），Sp2/0-Ag14（Schulman et al,1978）等，這些細(xì)胞株皆為HAT敏感細(xì)胞株。 使用細(xì)胞融合劑造

4、成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細(xì)胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇（PEG 10002000）是目前最常用的細(xì)胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40（W/V）。 （二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用 細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過(guò)程。在小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合細(xì)胞懸液中，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，如融合的脾細(xì)胞和瘤細(xì)胞、融合的脾細(xì)胞和脾細(xì)胞、融合的瘤細(xì)胞和瘤細(xì)胞、未融合的脾細(xì)胞、未融合的瘤細(xì)胞以及細(xì)胞的多聚體形式等。正常的脾細(xì)胞在培養(yǎng)基中存活僅57天，無(wú)需特別篩選 ，細(xì)胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細(xì)胞則需進(jìn)行特別的篩選去除。 細(xì)胞的DNA合成一

5、般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進(jìn)而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過(guò)程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成份：次黃嘌呤（hypoxanthine,H）、氨甲喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。氨甲喋呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT- 細(xì)胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。只有融合細(xì)胞具有親代雙方

6、的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長(zhǎng)期存活與繁殖。 （三）有限稀釋與抗原特異性選擇 在動(dòng)物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。一種抗原往往有多個(gè)決定簇，一個(gè)動(dòng)物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答，實(shí)質(zhì)是眾多細(xì)胞群的抗體分泌。而針對(duì)目標(biāo)抗原表位的細(xì)胞只占極少部分。由于細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，在已經(jīng)融合的細(xì)胞中，有相當(dāng)比例的無(wú)關(guān)細(xì)胞的融合體，需經(jīng)篩選去除。篩選過(guò)程一般分兩步進(jìn)行：一是融合細(xì)胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的特異性抗體篩選。將融合的細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細(xì)胞數(shù)在0至數(shù)個(gè)細(xì)胞之間（30%的孔為0才能保證每個(gè)孔中是單個(gè)細(xì)胞），培養(yǎng)后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性細(xì)胞；這

7、一過(guò)程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽(yáng)性細(xì)胞再行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株，增殖后進(jìn)行凍存、體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種培養(yǎng)。 第二節(jié) 制備單克隆抗體的基本技術(shù) 制備單克隆抗體是復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的工作，整個(gè)技術(shù)流程如圖5-2。 動(dòng)物免疫 ELISA法測(cè)定抗血清 分離脾細(xì)胞 制備骨髓瘤細(xì)胞 飼養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞融合 HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞 陽(yáng)性孔克隆化并擴(kuò)大培養(yǎng) 細(xì)胞凍存 飼養(yǎng)細(xì)胞 再次克隆化 克隆擴(kuò)大培養(yǎng) 細(xì)胞凍存 擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清 動(dòng)物接種收集腹水 單克隆抗體純化保存 圖5-2 雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的線路流程 （一）抗原提純與動(dòng)物免疫 對(duì)抗原的要求是純度越高越

8、好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1107 個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫?？扇苄钥乖杓油耆Ｊ献魟┎⒔?jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動(dòng)物免疫。 選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/C健康小鼠，鼠齡在812周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)不佳或免疫過(guò)程中死亡，可同時(shí)免疫34只小鼠。 免疫過(guò)程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為最終目的。免疫間隔一般23周。一般來(lái)說(shuō)，被免疫動(dòng)物的血清抗體效價(jià)越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親合力）也與免疫過(guò)程中

9、小鼠血清抗體的效價(jià)和親和力密切相關(guān)。末次免疫后34天，分離脾細(xì)胞融合。 （二）骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 選擇瘤細(xì)胞株的最重要的一點(diǎn)是與待融合的細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，第一節(jié)中所述各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長(zhǎng)密度為9105 /ml，倍增時(shí)間通常為1015小時(shí)。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性俱佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95%）。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2105 /ml，次日一般即為對(duì)數(shù)

10、生長(zhǎng)期細(xì)胞。 在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時(shí)，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercells ）。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中有巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。par 在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，切忌針頭刺破動(dòng)物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會(huì)有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1105 /ml，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。 （三）細(xì)胞融合 細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后以培養(yǎng)液

11、稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過(guò)程中有幾個(gè)問(wèn)題應(yīng)特別注意。細(xì)胞比例 骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例，應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。反應(yīng)時(shí)間 在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1分鐘滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2分鐘滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。培養(yǎng)液的成份 對(duì)融合細(xì)胞而言，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營(yíng)養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時(shí)核查培養(yǎng)基情況。 （四）有限稀釋法 篩選陽(yáng)性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT 敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能持續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈

12、克隆生長(zhǎng)，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個(gè)細(xì)胞 /孔），按Poisson法計(jì)算，應(yīng)有36%的孔為1個(gè)細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋10%20%孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的ELISA測(cè)定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)或凍存。 （五）單克隆抗體的制備和凍存 篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早進(jìn)行抗體制備，因?yàn)槿诤霞?xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)生污染、染色體丟失和細(xì)胞死亡的機(jī)率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基，以利于單克隆

13、抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/C小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集510ml的腹水,有時(shí)甚至超過(guò)40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達(dá)數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5105 鼠，可根據(jù)腹水生長(zhǎng)情況適當(dāng)增減。 選出的陽(yáng)性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在-70冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種，凍存過(guò)程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護(hù)劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50%95%之間。如果低于50%，則說(shuō)明凍存復(fù)蘇過(guò)程有問(wèn)題。 （六）單克隆抗體的純化 單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水中特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果較好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過(guò)濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡(jiǎn)便的酸沉淀方法。目前最有效的