淺論SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定

1、淺論SD大鼠腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定                 作者：何錦園,曾國華,吳文起,鐘文,桂志明,麥贊林 【摘要】  目的：探討大鼠腎小管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定方法，為腎結(jié)石病的研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。方法：采用機(jī)械研磨、型膠原酶消化法分離出腎小管節(jié)段，在含10%胎牛血清和1%上皮細(xì)胞生長因子的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，并用原代和傳1代細(xì)胞做免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)至

2、第3天完全貼壁，47 d處于對數(shù)生長期，為多邊鵝卵石樣;免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示cytokeratin 18表達(dá)陽性。結(jié)論:機(jī)械研磨、型膠原酶消化法結(jié)合使用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基可以培養(yǎng)得到較純的腎小管，是大鼠腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的理想方法,為進(jìn)一步研究泌尿系結(jié)石病因和機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  腎小管上皮細(xì)胞; 原代培養(yǎng); CK18; 大鼠Abstract Objective： To discuss the method of the primary culture and identification of SD rats renal tubular epithelial cell

3、s, thus to supply an experimental platform for the study of renal calculi.Methods： The renal tubular segments were isolated by mechanical grinding and collagenase digestion. The collected cells were cultured with EpiCM,which contained 10% FBS and 1% EpicGs, in incubation with 5% CO2 at 37 , and subc

4、ultured with 0.25% trypsin.The cultured cells were identified by immunocytochemistry. Results: The cultured cells were completely adhered after 3 days, the logarithmic growth phase was beween 4 and 7 days. The cells were large, displaying the typical cobblestone appearance.Immunocytochemistry sugges

5、ted that the expressions of cytokeratin 18 in renal tubular epithelial cells were positive. Conclusion: Mechanical grinding and collagenase digestion combined with EpiCM is an ideal method to collect and culture the renal tubular epithelial cells,and it provides the experimental basis for further st

6、udy of the etiology and mechanism of urinary tract stones.Key words renal tubular epithelial cells; primary culture; CK18; rats尿石癥是泌尿外科最常見的疾病之一，主要病因包括遺傳、環(huán)境、飲食、代謝等。一般認(rèn)為,它的形成是一系列化學(xué)的、生化的、生理的及分子調(diào)節(jié)等因素綜合作用的結(jié)果1，其早期病變是微小晶體黏附在腎小管上皮細(xì)胞表面并引起損傷。可見，腎小管上皮細(xì)胞可以作為進(jìn)一步研究尿石癥病因及發(fā)病機(jī)制的一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。目前，國外已建立部分種屬的腎小管上皮細(xì)胞株，但價(jià)格昂貴且不易獲

7、得。本實(shí)驗(yàn)旨在探討一種理想的腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。1 材料和方法1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠2只，一雄一雌，體重分別為220 g和200 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供許可證號為SCXK(粵)20080020粵監(jiān)證字2008A002。主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)、上皮細(xì)胞培養(yǎng)基EpiCM(美國ScienCell公司)、型膠原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/鏈霉素(Sigma公司)、cytokeratin 18一抗(美國Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奧森公司)、上皮細(xì)胞生長因子EpicGs(美國ScienCell公司)、PV9005

8、小鼠超敏二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)、ZLI9017濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋)。主要儀器：80和100目不銹鋼篩網(wǎng)(廣州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)、熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)。1.2 方法1.2.1 腎小管節(jié)段的分離提取 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，水?dāng)z入不限。頸椎脫臼后于70%酒精中浸泡23 min后取出，在超凈臺(tái)上無菌取下兩側(cè)腎臟。在盛有PBS培養(yǎng)皿中去除腎蒂和包膜，剪碎腎皮質(zhì)至約1 mm3大小(冰上操作)，PBS反復(fù)沖洗3遍去除血質(zhì)后轉(zhuǎn)移到80目篩網(wǎng)上，研磨并以PBS充分沖洗，網(wǎng)下液

9、體倒至100目篩網(wǎng)上，收集網(wǎng)上物于培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打轉(zhuǎn)至15 ml離心管，1 200轉(zhuǎn)·min-1離心10 min。1.2.2 腎小管節(jié)段的消化和腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng) 離心后棄上清，加入1 mg·ml-1的型膠原酶2 ml,0.1 mg·ml-1的DNase 0.1 ml,充分混勻，37 水浴震蕩消化約30 min，加入不含血清的EpiCM 2 ml終止消化，混勻，1 600轉(zhuǎn)·min-1離心6 min，棄去上清，加入4 ml含10%胎牛血清、1%上皮細(xì)胞生長因子、1%雙抗的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基EpiCM，吸管充分輕輕混勻后移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，在5%

10、 CO2、37 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.3 腎小管上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)至第3天首次換液，以后每兩天換1次，至第6天細(xì)胞基本鋪滿整個(gè)瓶底，吸去瓶內(nèi)全部培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，分兩組進(jìn)行消化，各滴加0.25%胰蛋白酶(A組)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA復(fù)合液(B組)1.52.0 ml(以剛好能全部覆蓋瓶底細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn))，37 消化12 min，鏡下見約85%細(xì)胞收縮、變圓，少許脫落，此時(shí)立即加入雙倍的含10%胎牛血清、1%上皮細(xì)胞生長因子、1%雙抗的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基EpiCM，用吸管順瓶底輕輕吹打使細(xì)胞完全脫落、充分混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以12的比例傳代培養(yǎng)。1.2.4 腎小管上皮細(xì)

11、胞的鑒定 形態(tài)學(xué)：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，透明度和折光性較強(qiáng)，各細(xì)胞緊密相連。免疫細(xì)胞化學(xué)：將傳1代的腎小管上皮細(xì)胞接種于裝有蓋玻片(經(jīng)泡酸、滅菌處理)的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞約長滿時(shí)取出蓋玻片。PBS沖洗2次，4%冷多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗2次后加3% H2O2去離子水孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，cytokeratin 18一抗(1400)4 過夜(陰性對照用PBS替代一抗)，二抗(即用型)37 孵育1.5 h，再DAB顯色、自來水沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。普通光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果。2 結(jié) 果剛提取的腎小管節(jié)段如圖1所示。原代培養(yǎng)的腎

12、小管上皮細(xì)胞12 h左右即有貼壁，2436 h后可見上皮樣細(xì)胞從貼壁的節(jié)段外周爬出，使得此時(shí)整個(gè)培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞呈“島嶼狀”(圖2)，培養(yǎng)第3天后首次換液。第47天是對數(shù)生長期，約67 d基本長滿瓶底(圖3)。鏡下觀察細(xì)胞體積較大，呈多邊鵝卵石樣，透明度和折光性較強(qiáng)。傳代細(xì)胞A組第2天貼壁，第56天呈指數(shù)性生長，形態(tài)多為短梭形，少數(shù)呈多邊形鵝卵石樣;B組3 d后少量細(xì)胞貼壁,形態(tài)不一,細(xì)胞連接不緊密,折光性較差,至第7天左右細(xì)胞全部漂浮、死亡。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測腎小管上皮細(xì)胞特異性表達(dá)的cytokeratin 18，在鏡下可見腎小管上皮細(xì)胞的胞核周圍及胞質(zhì)內(nèi)有不均勻分布的棕褐色顆粒(圖4、5)

13、，而陰性對照組未見到(圖6)，證明培養(yǎng)的是腎小管上皮細(xì)胞。3 討 論盡管關(guān)于泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制在國內(nèi)外已有不少研究，但仍存在一些未曾闡明的問題。目前已有多種學(xué)說，如腎鈣斑學(xué)說、過飽和結(jié)晶學(xué)說、基質(zhì)學(xué)說等?？偠灾I結(jié)石的形成是一個(gè)多因素參與的過程，包括尿液的過飽和、微小晶體的形成及結(jié)晶的生長和成熟等。其中，微小晶體黏附于腎小管上皮細(xì)胞表面并引起損害被認(rèn)為是腎結(jié)石形成過程中關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)3-4。由此可見，利用體外培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，可以更進(jìn)一步研究闡述泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制。目前，國內(nèi)外已建立了豬、兔、大鼠和人等多種不同種屬的腎小管上皮細(xì)胞株，雖然可以在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量足夠的細(xì)胞

14、，但價(jià)格昂貴且不易獲得。況且，在反復(fù)傳代過程中細(xì)胞株會(huì)喪失某些功能甚至發(fā)生轉(zhuǎn)分化等，不能完全代表其正常的生理狀況,且可能還具一些致瘤性，因此不適合研究的需要。腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法除應(yīng)用細(xì)胞株培養(yǎng)外，還有另外兩種方法。其一是先分離篩選出腎小管節(jié)段，然后進(jìn)行培養(yǎng);其二是van Kooten等報(bào)道的通過選擇性培養(yǎng)基促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長，同時(shí)抑制其他細(xì)胞的生長。雖然原代培養(yǎng)技術(shù)要求高、傳代次數(shù)有限，但它更接近生理狀況，細(xì)胞的變化相對穩(wěn)定，既沒有損傷也沒有嚴(yán)格的研究時(shí)間限制。目前，國內(nèi)外有報(bào)道用Percoll密度梯度離心法分離腎小管細(xì)胞，Percoll為一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒，它具有不穿透生物

15、膜，對細(xì)胞無毒害的作用，其密度為1.130 g·ml-1,可根據(jù)活細(xì)胞、接近死亡的細(xì)胞以及細(xì)胞碎片密度不同而將其分離開,以獲得活性較好的細(xì)胞5,9-10。但是，用此法大大增加了細(xì)胞提取的操作時(shí)間，也會(huì)影響細(xì)胞的活性，另外Percoll密度梯度離心法所獲得的腎小管節(jié)段數(shù)量少。Mattila等報(bào)道,采用研磨、篩網(wǎng)過濾的方法能達(dá)到分離腎小管節(jié)段和腎小球的目的11。本研究應(yīng)用80目和100目孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)分離腎小管,可以排除腎小球上皮細(xì)胞的混雜，腎小管細(xì)胞的純度可達(dá)到90%以上，且與Percoll密度梯度離心法相比，研磨消化法獲得的細(xì)胞數(shù)量較多。對于腎小管上皮細(xì)胞的消化，國內(nèi)報(bào)道多采用胰蛋

16、白酶，但是濃度難以確定，過高(0.25%)會(huì)影響細(xì)胞貼壁和生長，甚至無法傳代;過低又不能很好地消化細(xì)胞12-13。用1 g·L-1的型膠原酶消化2030 min效果佳，培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁率高，長勢良好。在原代培養(yǎng)中，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用上皮細(xì)胞培養(yǎng)基和上皮細(xì)胞生長因子，可以使成纖維細(xì)胞和其他一些雜細(xì)胞的增殖大部分甚至完全被抑制，從而有利于上皮細(xì)胞的生長，得到的細(xì)胞純度高7,14。在原代細(xì)胞生長至第6天傳代培養(yǎng)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代后的細(xì)胞貼壁和生長情況良好;而用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA復(fù)合液消化，腎小管細(xì)胞貼壁需要時(shí)間長且數(shù)量少，無法繼續(xù)生長，原因可能是腎小管上皮細(xì)胞對ED

17、TA敏感，EDTA對其有抑制性。         上皮細(xì)胞中間纖維結(jié)構(gòu)中含有角蛋白成分，是上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志。腎小管上皮細(xì)胞主要表達(dá)cytokeratin 1815,盡管有報(bào)道腎小球足細(xì)胞、球囊上皮細(xì)胞也有角蛋白表達(dá)(未明確是否為18型),但使用研磨、分離方法已將腎小管和腎小球細(xì)胞分離純化，故不會(huì)對實(shí)驗(yàn)造成影響。本實(shí)驗(yàn)采用原代和傳一代的細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，選擇cytokeratin18一抗(濃度為1400)進(jìn)行特異性鑒定。鏡下均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周圍有棕褐色不均勻散在分布、強(qiáng)度不一的陽性顆粒，再結(jié)合上皮細(xì)胞

18、的鏡下特點(diǎn)(典型的多邊鵝卵石狀,細(xì)胞間相連緊密)，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是腎小管上皮細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)較難，各方面要求較高，通過多次培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)過程中我們體會(huì)到以下幾點(diǎn)的重要性：(1) 腎小管節(jié)段的獲取必須嚴(yán)格無菌。(2) 腎小管細(xì)胞的消化盡量選用型膠原酶，效果佳。對于使用胰蛋白酶，沒有明確的推薦濃度。國內(nèi)王東等提出胰蛋白酶的濃度為0.2%0.25%時(shí)對腎小管細(xì)胞消化較好12。而廖曉星等報(bào)道0.2%以上的濃度將明顯影響腎小管細(xì)胞的貼壁和生長，并建議以0.15%為宜13。(3) 在分離培養(yǎng)后的前3 d內(nèi),由于組織塊粘貼不牢,盡量不要移動(dòng)培養(yǎng)瓶。(4) 72 h后首次換液,若細(xì)胞貼壁不理想可以

19、半換液，但在操作中注意動(dòng)作輕巧,避免因液體震蕩對細(xì)胞的沖擊引起其漂浮。以后依據(jù)細(xì)胞生長情況及時(shí)換液，一般每兩天1次，否則漂浮物會(huì)對細(xì)胞有毒性作用。(5) 使用一次性塑料培養(yǎng)瓶的腎小管細(xì)胞貼壁所需時(shí)間比用玻璃培養(yǎng)瓶短，且生長更好。本實(shí)驗(yàn)證明，采用機(jī)械研磨、型膠原酶消化法分離腎小管節(jié)段，結(jié)合使用含EpicGs的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基原代培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞是一種理想的方法，為進(jìn)一步研究泌尿系結(jié)石的病因及機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】  1 BIGELOW M W, WIESSNER J H, KLEINMAN J K, et al. Calcium oxalate crystal attachm

20、ent to cultured kidney epithelial cell linesJ. J Urol,1998,160:15281532. 葉章群,鄧耀良,董誠.泌尿系結(jié)石M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:102105. BIGELOW M G, JOHN H, WIESSNERNEIL S, et al. Calcium oxalatecrystal membrane interactions:dependence on membrane lipidcompositionJ. J Urol,1996,155:10941018. LIESKE J C, TOBACK F G. Regu

21、lation of renal epithelial cell endocytosis of calcium oxalate monohydrate crystals J.Am J Physiol,1993,264：F800F808. 毛慧娟,王笑云,徐昌芬，等. 人腎近端小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代及鑒定方法研究J.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(6):561564. 嚴(yán)玉澄,錢家麒,戴慧莉，等.人近端小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)J.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,24(4):388391. van KOOTEN C, LAM S, DAHA M R, et al. Isolation, cul

22、ture, characterization and use of human renal tubular epithelial cellsJ. J Nephrol,2001,14:204210. RYAN M J, JOHSON G, KIEK J, et al. HK22: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidneyJ.Kidney Int,1994,45:4857. SUTTERLIN G G, LAVERTY G. Characterization of a primary cell culture model of the avi