復(fù)方丹參方的藥效物質(zhì)及作用機(jī)理研究

1、復(fù)方丹參方的藥效物質(zhì)及作用機(jī)理研究張伯禮1 王永炎2 高秀梅1 商洪才1 孫有富2 王義明3潘桂湘1 郭利平1 胡利民1 王 怡1 張 萌1 劉密新3 趙宜軍2（1. 天津中醫(yī)學(xué)院 300193；2. 中國(guó)中醫(yī)研究院 100700；3. 清華大學(xué) 100084）摘要：中醫(yī)藥治病的原則是“調(diào)整陰陽(yáng)，以平為期”。以方劑為載體，注重整體，采用辨證論治的方法，進(jìn)行綜合治療的思想符合現(xiàn)代治療學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)。然而中醫(yī)藥缺乏對(duì)藥效物質(zhì)的微觀分析和作用機(jī)理的科學(xué)闡釋，成為影響中醫(yī)藥迅速發(fā)展的瓶頸。因此，以復(fù)方丹參方為范例，從方劑的配伍配比、作用機(jī)理、藥效物質(zhì)等方面進(jìn)行系統(tǒng)的研究，不僅證實(shí)了復(fù)方丹參方多組分、多靶

2、點(diǎn)治療心血管病假說(shuō)的科學(xué)性，而且為經(jīng)典處方的二次開發(fā)提供了一種模式。本項(xiàng)工作將豐富現(xiàn)代藥物治療學(xué)，促進(jìn)方劑配伍的科學(xué)詮釋，開拓中藥新藥創(chuàng)制新思路，構(gòu)建創(chuàng)新中藥的理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：復(fù)方丹參方 藥效物質(zhì) 作用機(jī)理 配伍配比方劑是一個(gè)復(fù)雜體系，方劑作用的人體也是一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)。面對(duì)雙重復(fù)雜系統(tǒng)，要想認(rèn)識(shí)它，必須將復(fù)雜系統(tǒng)中非線性規(guī)律部分降解為線性規(guī)律去研究，多個(gè)線性規(guī)律的綜合有助于復(fù)雜系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，因此研究方劑必須遵循“復(fù)雜簡(jiǎn)單復(fù)雜”的原則，發(fā)揮自身的綜合優(yōu)勢(shì)，保持中藥原方的配伍特點(diǎn)，同時(shí)借鑒西藥的“分析”方法，通過(guò)有效組分的配伍配比規(guī)律研究，最終構(gòu)建藥效組分基本清楚，作用靶點(diǎn)及原理基本清楚，高效低毒的

3、現(xiàn)代中藥。作為藥典方，復(fù)方丹參的生產(chǎn)廠家較多，且沒有合理的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，制劑呈現(xiàn)多樣性。同時(shí)各種劑型使用丹參和三七不同的有效組分，導(dǎo)致了臨床療效差異，而且丹參、三七、冰片不同組分在心肌缺血病理環(huán)節(jié)中各自的作用亦不明確，影響了復(fù)方丹參方的作用發(fā)揮。我們以復(fù)方丹參為基礎(chǔ)方，進(jìn)行了藥效物質(zhì)、配伍配比及作用機(jī)理的研究。研究?jī)?nèi)容：1 明確丹參、三七在全成分、有效組分層次的配伍配比規(guī)律。配伍配比是方劑的核心與靈魂所在，是中醫(yī)藥的特色和優(yōu)勢(shì)，它既不是簡(jiǎn)單的藥物作用在數(shù)量上的相加，也不是機(jī)械的毒副反應(yīng)的抵消，而是在辨證立法基礎(chǔ)上，以法統(tǒng)方，立方遣藥，有序組合而成的有制之師。1.1 丹參、三七全成分的配伍配比規(guī)律研

4、究【1，2】?jī)?yōu)選丹參/三七最佳配比是本項(xiàng)研究的主要內(nèi)容。在進(jìn)行飲片（全成分）層次配伍研究的同時(shí)，為組分配伍研究提供技術(shù)平臺(tái)和方法學(xué)基礎(chǔ)，為效應(yīng)明確小復(fù)方的二次開發(fā)提供一種模式，同時(shí)為研制現(xiàn)代中藥提供科學(xué)依據(jù)。在整體水平上，應(yīng)用犬冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法造成急性心肌缺血模型，并與血流動(dòng)力學(xué)模型有機(jī)結(jié)合，著眼于全成分、整體動(dòng)物、多效應(yīng)指標(biāo)動(dòng)態(tài)觀察，建立了基線等比增減設(shè)計(jì)方法，對(duì)丹參/三七的不同比例： 10/0、10/1、10/3、10/6、10/10、1/10、0/10進(jìn)行了多效應(yīng)比較藥效學(xué)研究。效應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)涉及到心外膜心電圖（-ST、N-ST ）、心肌組織缺血區(qū)范圍、心肌生化標(biāo)志物（cTnI、CK

5、-MB）、冠脈血流量、心肌耗氧量、血流動(dòng)力學(xué)、一氧化氮、內(nèi)皮素、自由基等。結(jié)果表明：1. 以丹參為主的藥對(duì)比例組，即10/6、10/3、10/1、10/0，有明顯改善犬心肌缺血的作用，減輕由心外膜心電圖所標(biāo)測(cè)的心肌缺血程度，減少通過(guò)TTC染色所顯示的缺血區(qū)。2. 以丹參為主的藥對(duì)比例組對(duì)心肌鈣蛋白的增高有明顯的抑制作用，反映了丹參對(duì)心血管的直接作用強(qiáng)于三七。這與心外膜心電圖、心肌染色所反映的結(jié)果基本一致。3. 在對(duì)冠脈血流量有效增加的各組中，以丹參為主的藥組（10/0、10/3、10/6）作用較強(qiáng)。消心痛組在給藥后30min即發(fā)揮作用，但很快減弱；而中藥組（10/0、10/3、10/6）作用平

6、穩(wěn)而持久、穩(wěn)中有升，遠(yuǎn)后效應(yīng)明顯。4.10/6、10/3兩組可以明顯改善左室收縮及舒張功能，增加心輸出量及心臟指數(shù)，減少血管總外周阻力，而左室做功沒有明顯增加，心率、平均動(dòng)脈壓的波動(dòng)較小。5.0/10組（單純?nèi)撸┘却龠M(jìn)NO的釋放、保護(hù)SOD活性，又降低ET含量、減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物效應(yīng)。在細(xì)胞水平上，應(yīng)用心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）模型，對(duì)丹參、三七的上述7種比例進(jìn)行了研究，其指標(biāo)涉及到MTT、LDH、NO、ET等。結(jié)果表明：1.在正常培養(yǎng)條件下，丹參可促進(jìn)CMEC增殖，三七反之，配比隨著丹參量的減少和三七量的加大增殖效果減弱；對(duì)于NO和ET均有降低趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2

7、.在缺O(jiān)2損傷條件下，丹參促進(jìn)CMEC增殖，三七反之，配比在101106范圍內(nèi)，隨三七量加大，促進(jìn)CMEC增殖趨勢(shì)明顯。而在1010010范圍內(nèi)，隨丹參量的減少，三七量的加大，CMEC增殖趨勢(shì)減弱，各配比組均可顯著降低NO釋放（除106 P>0.05外均P<0.01），且有降低ET分泌水平的趨勢(shì)，而尤以101和106效果最佳。 1.2 丹酚酸B、丹參酮A組分配伍配比規(guī)律研究【3】丹參作為復(fù)方丹參方中的君藥，具有重要的藥理作用。丹參的主要水溶性物質(zhì)丹酚酸B、脂溶性提取物丹參酮A有各自的藥理活性，兩者配伍后有何藥效變化；針對(duì)不同的體外培養(yǎng)細(xì)胞：CMEC、心肌細(xì)胞（CM），兩者又有何不同

8、的作用重點(diǎn)；對(duì)于心臟的保護(hù)作用，兩者配伍后的最佳比例是多少,都是有待回答的問(wèn)題。研究以丹酚酸B、丹參酮A為配伍，以缺氧、腫瘤壞死因子（TNF-）為刺激因素，心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）、心肌細(xì)胞（CM）為靶細(xì)胞，觀察不同配伍后的藥效變化并從中尋找二者作用的最佳比例和各自的作用靶點(diǎn)及機(jī)制。結(jié)果表明：.CMEC缺氧損傷時(shí)，各配比組均可提高CMEC活力，降低LDH釋放，丹酚酸B、丹參酮A配伍后的作用優(yōu)于單一藥物，且以28組最顯著；各配比組均有降低NO合成、ET釋放的趨勢(shì)。.CMEC被TNF-損傷時(shí)，各配比組均可提高CMEC活力，降低LDH釋放，丹酚酸B與丹參酮A配伍后的作用強(qiáng)于單一藥物，且以55組

9、為最佳；各配比組均有增加SOD活性，減少M(fèi)DA產(chǎn)量的趨勢(shì)，丹參酮A抗氧化損傷的能力最強(qiáng)。丹參酮A提高NO合成、減少ET的釋放的作用最顯著。.CM缺氧損傷時(shí)，各配比組對(duì)CM增殖的作用不明顯，但丹酚酸B的作用強(qiáng)于丹參酮A；丹酚酸B、丹參酮A配伍后減少LDH釋放、NO合成的作用強(qiáng)于兩者單獨(dú)使用，且以55的比例為最佳。.CM被TNF-損傷時(shí)，各配比組均能明顯減輕細(xì)胞的損傷程度，表現(xiàn)在細(xì)胞活力增強(qiáng)，LDH釋放的減少，保護(hù)作用以82組最佳，55組次之；各配比組均有升高SOD，減少M(fèi)DA的作用，丹參酮A減少M(fèi)DA的作用最強(qiáng)。2 明確丹參、三七、冰片全成分、有效組分治療心肌缺血的途徑、靶點(diǎn)及整合調(diào)節(jié)作用規(guī)律。

10、復(fù)方丹參治療心肌缺血有較為系統(tǒng)的研究，一般認(rèn)為其有擴(kuò)冠、降低心肌耗氧量、抗血小板聚集等作用，但目前的研究工作不足以揭示臨床治療機(jī)制，其深層次的作用機(jī)理研究更少。已知其抗心肌缺血的機(jī)理不同于硝酸酯類化合物的釋放外源性一氧化氮使冠脈擴(kuò)張，但其通過(guò)何種途經(jīng)發(fā)揮對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用，其整合調(diào)節(jié)如何體現(xiàn)，是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。2.1 復(fù)方丹參方預(yù)處理加強(qiáng)缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)作用及機(jī)制研究【4】1986年Murry提出心肌缺血預(yù)適應(yīng)（Ischemic preconditioning, IPC）現(xiàn)象為心肌細(xì)胞保護(hù)及機(jī)理探討開辟了新領(lǐng)域，90年代受到廣泛重視，并開展了藥物預(yù)適應(yīng)研究。多數(shù)中藥發(fā)揮作用的途徑不同于

11、西藥的直接對(duì)抗和補(bǔ)充，而在于整合調(diào)節(jié)。復(fù)方丹參方治療心肌缺血是否因其激活內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)而發(fā)揮作用，尚不知曉。采用大鼠在體預(yù)適應(yīng)模型，觀察了復(fù)方丹參方模擬和加強(qiáng)缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明：再灌組、早晚期假性預(yù)適應(yīng)組壞死重量占缺血重量（IS/AAR）分別高達(dá)45、47、45；心律失常發(fā)生率也分別高達(dá)76.46、55.56、73.33；血清中LDH含量也顯著高于對(duì)照組，P<0.01。缺血預(yù)處理后，IPC早期組IS/AAR與早期假性預(yù)適應(yīng)組相比降低了17，晚期IPC組IS/AAR與晚期假性預(yù)適應(yīng)組相比僅降低4；早期IPC和晚期IPC組心律失常發(fā)生率分別為11.76、43.75，顯著低

12、于再灌和早晚期假性預(yù)適應(yīng)組，p<0.01；IPC后LDH釋放也減少。說(shuō)明缺血預(yù)適應(yīng)可縮小缺血范圍，減少心律失常的發(fā)生率。復(fù)方丹參方預(yù)處理后，在再灌、IPC基礎(chǔ)上IS/AAR進(jìn)一步縮小約1017，LDH釋放也減少，LDH含量以晚期藥物IPC組最低，與晚期假性預(yù)適應(yīng)組相比，P<0.05，但復(fù)方丹參方對(duì)心律失常的影響不明顯。另外復(fù)方丹參方預(yù)處理后，還可使血清中MDA下降，SOD活性增強(qiáng)。通過(guò)免疫組化和RT-PCR方法研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參預(yù)處理后可以使早、晚期IPC組和再灌組的心肌細(xì)胞iNOS、PKCmRNA和蛋白表達(dá)明顯加強(qiáng)，p<0.05，對(duì)再灌HSP70表達(dá)也有增加趨勢(shì)。2.2 丹

13、酚酸B預(yù)處理的心臟細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制研究【5，6】80年代，對(duì)丹參水溶性成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分離得到多種酚酸類化合物，在丹參水溶性酚酸類化合物中丹酚酸B的含量最高，因此，我們?cè)谛呐K微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMEC）和心肌細(xì)胞（CM）培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)上，基于缺氧預(yù)適應(yīng)（HPC）機(jī)制，建立缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷的細(xì)胞模型，以細(xì)胞活力（MTT）、乳酸脫氫酶（LDH）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、內(nèi)皮素（ET）等生化指標(biāo)及超微結(jié)構(gòu)變化為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，觀察了丹酚酸B預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)；并采用以蛋白激酶C（PKC）抑制劑chelerythrine、KATP通道阻滯劑優(yōu)降糖為工具藥的方式，在對(duì)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)

14、PKC、熱休克蛋白70（HSP70）的mRNA表達(dá)影響上，探討了丹酚酸B預(yù)處理細(xì)胞保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明：1.在正常培養(yǎng)條件下，丹酚酸B可明顯提高CMEC和心肌細(xì)胞的細(xì)胞存活率和SOD活性、降低LDH活性、維持正常的形態(tài)超微結(jié)構(gòu)，有降低CMEC的ET分泌和NO釋放趨勢(shì)。2.缺O(jiān)2預(yù)適應(yīng)可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷的耐受性，表現(xiàn)為可提高細(xì)胞存活率和SOD活性，降低LDH活性，而且能明顯降低CMEC因缺O(jiān)2/復(fù)O2導(dǎo)致的ET和NO水平升高，同時(shí)明顯改善其形態(tài)超微結(jié)構(gòu)變化。3.丹酚酸B預(yù)適應(yīng)具有與缺O(jiān)2預(yù)適應(yīng)相似的細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，對(duì)于CMEC表現(xiàn)為早期保護(hù)和延遲保護(hù)兩個(gè)時(shí)相。4.

15、KATP通道阻滯劑優(yōu)降糖不能消除HPC的CMEC保護(hù)作用，選擇性PKC抑制劑chelerythrine消除了HPC的CMEC保護(hù)效應(yīng)，丹酚酸B預(yù)適應(yīng)可以使CMEC被PKC抑制劑阻斷的HPC效應(yīng)重現(xiàn)。5.在早期預(yù)適應(yīng)中，丹酚酸B預(yù)適應(yīng)可促進(jìn)缺O(jiān)2/復(fù)O2損傷CMEC的HSP70 mRNA、PKC mRNA表達(dá)增強(qiáng)，且明顯優(yōu)于HPC；在晚期預(yù)適應(yīng)中，丹酚酸B預(yù)適應(yīng)同樣促使HSP70 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，且與HPC具有疊加效應(yīng)。3 明確復(fù)方丹參方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，化學(xué)成分指紋譜及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，為中藥質(zhì)量提高和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供技術(shù)壁壘。方劑的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不是某一單純成分，而是復(fù)雜的混合物，因此必須結(jié)合藥理學(xué)對(duì)方

16、劑藥效物質(zhì)降解分析，進(jìn)行有效組分和有效成分的化學(xué)篩選，建立規(guī)范的提取方法，進(jìn)行有效成分的指紋圖譜識(shí)別和指標(biāo)成分的定量分析，在主要藥效學(xué)導(dǎo)向下，制定藥材和方劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。選擇復(fù)方丹參方中的10個(gè)成分作為指標(biāo)【7，8】：丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1，采用高效液相色譜法對(duì)給藥前后復(fù)方丹參方中丹參水溶性成分、脂溶性成分及三七皂苷類成分進(jìn)行含量測(cè)定。根據(jù)這些成分理化性質(zhì)間的差異，建立了色譜條件。對(duì)丹參、三七各配比（生藥量之比：10/0、10/1、10/3、10/6、10/10、1/10、0/10）組方中主要成分的

17、含量及穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定和考察。在此基礎(chǔ)上還對(duì)大鼠灌服復(fù)方丹參方后血清中的丹參素、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1進(jìn)行檢測(cè)和藥物動(dòng)力學(xué)研究。研究結(jié)論： 1. 復(fù)方丹參方不僅具有抗心肌缺血的作用，而且有增強(qiáng)缺血預(yù)適應(yīng)效果。作用機(jī)制可能是擴(kuò)冠和激活內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放。 2. 丹參的作用靶點(diǎn)側(cè)重于血管，其擴(kuò)張冠脈的效應(yīng)強(qiáng)于三七；三七的作用靶點(diǎn)側(cè)重于心肌，其對(duì)缺氧心肌的保護(hù)作用強(qiáng)于丹參； 3. 結(jié)合化學(xué)結(jié)果分析得出：二者配伍后存在協(xié)同互補(bǔ)效應(yīng)，三七皂苷類成分可使丹參水溶、脂溶成分的含量穩(wěn)定。丹參水溶性成分吸收入血較快（藥后30min），擴(kuò)冠效應(yīng)強(qiáng)，更適于速效；而丹參脂溶性成分和三七皂苷類成分吸引入血較慢（

18、藥后60min），遠(yuǎn)后效應(yīng)明顯，更適宜長(zhǎng)效。 4. 丹酚酸B與丹參酮IIA均有抗心肌缺血的作用，但各有側(cè)重。5. 復(fù)方丹參方中丹參的水溶性成分以丹酚酸B含量為最高，其次是丹參素、原兒茶醛；丹參脂溶性成分的含量高低依次為隱丹參酮、丹參酮A、丹參酮I；三七皂苷類成分則以人參皂苷Rg1含量為最高，其次是人參皂苷Rb1、三七皂苷R1，再次為人參皂苷Re。6. 復(fù)方丹參方中各類成分的穩(wěn)定性是三七皂苷類成分強(qiáng)于丹參水溶性成分，而水溶性成分的穩(wěn)定性又優(yōu)于脂溶性成分。復(fù)方丹參方配比不同時(shí)，同類成分間的穩(wěn)定性有所差異，其穩(wěn)定性隨著三七在處方中所占比例的增大而呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，說(shuō)明復(fù)方丹參方中各主要成分的含量及穩(wěn)定性

19、與配伍配比存在一定的相關(guān)性。7. 建立的方法可作為復(fù)方丹參方各主要成分的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)方丹參方中的丹酚酸B、丹參素、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1可經(jīng)胃腸道吸收入血，提示可能為主要藥效成分。 展望：方劑的現(xiàn)代化研究是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的系統(tǒng)工程。要完成表征現(xiàn)代化（工藝、質(zhì)控、包裝）相對(duì)容易，而內(nèi)涵現(xiàn)代化（從飲片配伍到組分配伍）的實(shí)現(xiàn)卻可能要付出幾代人的努力。方劑關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題（藥效物質(zhì)和作用原理兩個(gè)基本清楚；單味藥、有效組分、化學(xué)成分三個(gè)化學(xué)層次；整體、組織、細(xì)胞、分子四個(gè)藥理水平以及在此基礎(chǔ)上的配伍配比）的解決，是今后方劑研究的重點(diǎn)。參考文獻(xiàn)1.商洪才，張伯禮，高秀梅，等.丹參三七藥對(duì)不同配比藥

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