分子生態(tài)學在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應用

1、分子生態(tài)學研究方法與技術(shù)在環(huán)境微生物領(lǐng)域的應用 （專業(yè)：09微生物 姓名：柴化建 學號：s9071005478） 摘要：對環(huán)境微生物的研究有助于利用環(huán)境微生物解決環(huán)境污染的問題。微生物是廢水處理、城市生活垃圾填埋或堆肥處理等系統(tǒng)中的主要功能生物，充分認識其中的微生物學原理能為改進處理工藝、提高處理效率提供依據(jù)。通過利用分子生態(tài)學的研究方法和技術(shù)，從分子的活動變化規(guī)律來閘釋環(huán)境微生物生態(tài)變化及生物分子活動過程與機理，從而應用于環(huán)境治理領(lǐng)域。關(guān)鍵字：環(huán)境微生物 熒光雜交 蛋白質(zhì)組學 宏基因組學 微陣列 環(huán)境在不同的生命層次（分子水平，個體水平，種群水平，及群落水平，甚至生態(tài)系統(tǒng)水平）對生命活動產(chǎn)生

2、不同的影響，生物體也是通過在不同水平層次上的調(diào)節(jié)來適應和改變環(huán)境。 在環(huán)境微生物領(lǐng)域，對環(huán)境中微生物的主要類群及它們的生理、生態(tài)特性、微生物與環(huán)境污染的關(guān)系、污染物的微生物降解及轉(zhuǎn)化規(guī)律等進行研究是重要的。目前研究環(huán)境微生物的主要方法仍是基于培養(yǎng)和分離純化的傳統(tǒng)技術(shù)，已經(jīng)無法滿足研究者對環(huán)境微生物進行快速、準確的分析與鑒定的要求。故從分子生態(tài)學方向入手將會給環(huán)境微生物的研究起到很大的推動總用。分子生態(tài)學應用分子生物學的原理和方法來研究生命系統(tǒng)與環(huán)境系統(tǒng)相互作用的生態(tài)機理及其分子機制。從微觀研究層次它主要涉及生態(tài)現(xiàn)象與生態(tài)規(guī)律的發(fā)生、演化與發(fā)展的分子生物學過程與機理，即怎樣利用DNA(基因)，蛋

3、白質(zhì)(酶)等生物活性分子的活動變化規(guī)律來閘釋生態(tài)變化的生物分子活動過程與機理。利用分子生態(tài)學研究方法與技術(shù)，從分子種群生物學、分子環(huán)境遺傳學和分子適應等幾個方面的內(nèi)容對環(huán)境微生物進行研究。以求改進微生物處理污染物的工藝、提高處理效率。一環(huán)境mRNAandrRNA同時熒光原位雜交 Giovannoni等在1988年首次將熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybirdization，F(xiàn)ISH)引入細菌學的研究，當時使用的是放射性標記rRNA寡核苷酸探針來檢測微生物。隨著熒光標記的發(fā)展，放射性標記被非同位素染料代替。1989年，DeLong首次使用熒光標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細

4、胞，熒光標記寡核苷酸探針比放射性探針更安全和具有更好的分辨力，并且不需要額外的檢測步驟。熒光原位雜交是利用熒光標記的特異核酸探針與細胞內(nèi)相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布，或者是結(jié)合了熒光探針的DNA或RNA分子在染色體或其它細胞器中的定位。由于rRNA在微生物體內(nèi)的拷貝數(shù)較高、分布廣泛、功能穩(wěn)定，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當?shù)谋Ｊ匦?，因此通常使用rRNA作為探針，但以rRNA作為探針的FISH只能分析群落的遺傳結(jié)構(gòu)，

5、不能明確揭示群落結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。Anneliepernthaler等將rRNA和mRNA同時FISH來研究環(huán)境細菌結(jié)構(gòu)和某一代謝活性之間的關(guān)系，作為一個例證研究，同時檢測環(huán)境微生物mRNA和rRNA，他們研究了pmoA(編碼甲烷單氧化酶A亞基)基因的在環(huán)境中的表達，很好地與群落功能活性聯(lián)系起來?？梢?，將環(huán)境rRNA和mRNA同時FISH來研究微生物群落功能是可行的。FISH技術(shù)可確定細胞和組織中特異性轉(zhuǎn)錄物定位及其表達的相對水平，它是用一標記生物素或地高辛的非同位素探針，和所制備樣本中的RNA進行雜交。地高辛內(nèi)標記的反義多聚核苷酸探針，在反轉(zhuǎn)錄過程中雜交到細菌細胞中，這一技術(shù)將是研究復雜群落

6、環(huán)境中原位基因表達較為有利的手段。另外，結(jié)合報告基因分析的FISH技術(shù)對于復雜微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能分析也是十分方便有利的。在微生物群落研究中利用FISH技術(shù)將原位雜交與功能研究結(jié)合是必然的發(fā)展趨勢，可以進行基因表達和代謝水平的研究。二穩(wěn)定性同位素聯(lián)合宏基因組技術(shù) 宏基因組(metagenomics)或環(huán)境基因組(environmentalgenomics)是特定環(huán)境內(nèi)所有生物遺傳物質(zhì)的和，是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)。它于1998年首先由Handelsman等¨提出，與傳統(tǒng)方法相比，宏基因組學是一種不依賴于純培養(yǎng)(cultivationindependent)的技術(shù)

7、方法。它直接從環(huán)境樣品中提取基因組DNA(environmentDNA，eDNA)，以獲得某一環(huán)境或共生體中所有微生物基因組的集合，然后將環(huán)境eDNA克隆到適當?shù)妮d體上，通常是質(zhì)粒、粘粒、細菌人工染色體(BAC)和不同類型的廣宿主或穿梭載體然后讓其在大腸桿菌、鏈霉菌、假單胞菌或根瘤菌等適宜宿主中表達H，構(gòu)建一個復雜度極高的宏基因組文庫，最后運用各種分析手段篩選出功能基因，并可以進一步對功能基因測序，推測活性產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，建立系統(tǒng)發(fā)生樹等。宏基因組技術(shù)能夠基于序列分析得到微生物群落潛在生態(tài)功能信息，但是，不能夠明確預測功能特別是在特異條件下才表達的基因。而且要從由環(huán)境復雜群落構(gòu)建的宏基因組文庫中獲

8、得特定的目標基因需要篩選和測序成千上萬的克隆。盡管通過宏基因組學的方法篩選到了一些功能基因，但隨機性太大。穩(wěn)定性同位素聯(lián)合宏基因組技術(shù)(SIPenabledmetagenomics)可大大減少克隆的數(shù)量。通過穩(wěn)定性同位素(SIP)實驗使參與特定代謝過程(例如甲烷氧化)的生物基因組得到富集，克隆從SIP實驗中獲得的”C標記的核酸，從而構(gòu)建出在某一特定的環(huán)境過程中執(zhí)行特定代謝功能(如可吸收或轉(zhuǎn)化、代謝特定的標記基質(zhì))的環(huán)境微生物的功能宏基因組文庫，就可重建一個較小、針對性強的目標微生物功能群基因組，從而極大地減少需要篩選的基因克隆數(shù)量。并且可直接利用分離出的”C一核酸構(gòu)建宏基因組克隆文庫。穩(wěn)定性同

9、位素聯(lián)合宏基因組技術(shù)可用于環(huán)境甲基營養(yǎng)菌(甲烷營養(yǎng)菌和甲醇營養(yǎng)菌)、有機污染物降解菌、根際微生物生態(tài)(植物微生物微動物相互作用)、厭氧環(huán)境中互營微生物等群落結(jié)構(gòu)和特定代謝過程功能分析，在微生物的種類鑒定和功能鑒定間建立了直接的聯(lián)系。三微陣列技術(shù) 微陣列技術(shù)自1995年由Schena創(chuàng)立以來J，已逐漸發(fā)展成為功能基因組學研究的最有力的工具之一。它作為一種強有力的基因技術(shù)，被廣泛地用于研究生物過程。雖然微陣列技術(shù)已被成功用于分析純培養(yǎng)全基因的表達，但是由于特異性、靈敏度和定量等問題，它在環(huán)境微生物群落研究中仍存在挑戰(zhàn)。根據(jù)探針的類型可將環(huán)境研究中的微陣列分為3類：功能基因微陣列(functiona

10、lgenearrays，F(xiàn)GAs)、群落基因組微陣列(communitygenomearrays，CGAs)和系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸微陣列_9J。其中，功能基因微陣列以代謝途徑中關(guān)鍵基因作為探針，研究微生物群落中的功能菌群在環(huán)境中的功能活性及其代謝途徑。為了構(gòu)建含有大片段DNA的FGAs，需要通過PCR方法從環(huán)境樣品的克隆中擴增制備探針，因此，對于得到不同環(huán)境樣品的克隆仍具有挑戰(zhàn)性。由于寡核苷酸微陣列特異性高，便于構(gòu)建，它可能是微生物生態(tài)學研究的重要方法。不過，雖然它在環(huán)境微生物群落功能研究中大有希望，但是這種微陣列技術(shù)并未得到嚴格的測試和環(huán)境中應用的驗證Rhee等發(fā)展了一個50個堿基的寡核苷酸微陣

11、列技術(shù)，用來自2402個已知的生物降解和重金屬抑制有關(guān)基因中的1657個探針研究了環(huán)境群落生物降解潛力和功能活性。結(jié)果證實50個堿基的寡核苷酸微陣列開發(fā)為微生物群落功能研究提供了新的快速、強大、高通量分析工具，可用于監(jiān)測生物修復潛力及功能活性微陣列技術(shù)已廣泛應用于研究廢水處理系統(tǒng)以及環(huán)境污染物中微生物參與的反應和調(diào)節(jié)過程和機制、養(yǎng)物循環(huán)和富營養(yǎng)作用的微生物多樣性、微生物生態(tài)學原理以及生物學過程中與環(huán)境脅迫反應相關(guān)的基因能和調(diào)節(jié)控制研究，并建立了基因表達譜，特別是寡核苷酸微陣列是當前環(huán)境微生物群落功能研究中的一有效手段。四環(huán)境蛋白質(zhì)組技術(shù) 蛋白質(zhì)組是一個細胞或組織所表達的全部蛋白質(zhì)組分?，F(xiàn)在比較

12、公認的概念是，在一種細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)組分。對于微生物群落來講，蛋白質(zhì)組學是對生物系統(tǒng)中所有蛋白的綜合分析，能夠揭示遺傳信息是怎樣轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑸锶郝涔δ艿亩鄻有?。在后基因組時代，微生物群落分析的一個主要的挑戰(zhàn)就是闡述宏基因組的功能，并把微生物群落遺傳結(jié)構(gòu)和它們的功能多樣性聯(lián)系起來。除前面所述的環(huán)境mRNA和rRNA同時熒光原位雜交和穩(wěn)定性同位素聯(lián)合宏基因組技術(shù)外，微生物群落功能也能通過轉(zhuǎn)錄組學(Metranscriptome)的方法研究，即提取環(huán)境樣品中的所有微生物的RNA，構(gòu)建16SrRNA基因克隆文庫或cDNA文庫，再做進一步研究。然而，由于RNA的半衰期較短，在抽提過程中難以去除腐殖質(zhì)

13、，相似基因在不同群體中有不同的轉(zhuǎn)錄動態(tài)，RNA和蛋白質(zhì)的低相關(guān)性，這些阻礙了Metranscriptome在土著微生物群落研究中的應用。正是這些限制，才使蛋白質(zhì)組學的方法逐步在微生物群落研究中開始得到應用。環(huán)境蛋白質(zhì)組學(Metaproteomics)最初由Wilmes和Bond命名，指大規(guī)模鑒定給定時間和地點的環(huán)境樣品的整個蛋白組分。基本程序包括：環(huán)境中總蛋白的提取、通過一維或二維凝膠電泳對蛋白進行分離、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析將群落遺傳結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，同時也可鑒定蛋白進行反向遺傳學研究。Wilmes和Bond成功地抽提和純化了來自優(yōu)化的生物除磷活性污泥的總蛋白，采用二維聚丙烯酰氨凝膠

14、電泳進行分離和蛋白指紋圖譜分析，并將高表達的蛋白質(zhì)點進行切除，確定了以四級桿飛行時間質(zhì)譜從頭多肽測序，分離的蛋白質(zhì)分別被鑒定為外膜蛋白(porin)、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶和ABC型支鏈氨基酸運輸系統(tǒng)蛋白組分，這些蛋白可能來自于活性污泥中尚未純培養(yǎng)的積累磷酸鹽的微生物。這是將蛋白質(zhì)組學方法用于研究水生微生物群落。自然界的微生物群落是極其復雜的動態(tài)系統(tǒng)，在后基因組時代，基于核酸分析的方法(不能夠揭示微生物群落的原位功能。大規(guī)模研究土著微生物表達蛋白(Metaproteome)能提供微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能信息，它有望把微生物群落的遺傳和功能多樣性聯(lián)系起來，更具體地說，對于不同環(huán)境的Metaprot

15、eomics的分析：(1)可以捕捉新的功能基因和代謝途徑；(2)鑒定與特異脅迫有關(guān)的蛋白。蛋白質(zhì)組學聯(lián)合宏基因組數(shù)據(jù)可以更好地揭示環(huán)境群落分類多樣性、功能多樣性和生物過程。五面臨的問題和展望 熒光原位雜交技術(shù)在微生物群落分析上有一定的應用，但是也存在許多缺陷和干擾因素：如許多霉菌、酵母菌和細菌(如假單胞菌屬、軍團菌屬)會有自身熒光，干擾熒光信號強度；在群落分析時，探針缺乏特異性等。微陣列技術(shù)由于實驗條件的限制，不能被廣泛接受。盡管宏基因組技術(shù)從提出到現(xiàn)在已經(jīng)在一定程度上得到了廣泛應用，發(fā)現(xiàn)了一些功能基因，但是就這項技術(shù)本身仍存在許多限制：(1)環(huán)境DNA的提取仍舊需要改善，沒有一個統(tǒng)一的核酸提

16、取程序，針對不同的環(huán)境樣品，需要摸索不同提取條件，以提高提取DNA的純度，進一步滿足構(gòu)建文庫的需要；(2)克隆的表達效率非常低；(3)需要構(gòu)建大片段宏基因組文庫以提高篩選完整功能基因簇的效率。環(huán)境蛋白質(zhì)組學剛剛開始得到應用，環(huán)境蛋白質(zhì)的提取和純化需要不斷的完善，為后續(xù)的分離和蛋白的鑒定提供條件。將環(huán)境基因組學和蛋白質(zhì)組學聯(lián)合來研究微生物群落功能或許較為可行，可以將群落組分與功能聯(lián)系起來。微生物群落對環(huán)境有著非常重要的意義。迄今，用分子生物學的方法來研究群落主要集中在鑒定物種，即微生物群落結(jié)構(gòu)的遺傳結(jié)構(gòu)分析，宏基因組學只能提供潛在的功能，幾乎沒有能力去證實原位功能。蛋白質(zhì)組學有潛力研究群落的功能信息，但微生物群落的蛋白質(zhì)組學正處在萌芽狀態(tài)，需要不斷地改進技術(shù)問題。技術(shù)上的聯(lián)合是必要的，例如熒光原位雜交和宏基因組的聯(lián)合，穩(wěn)定性同位素技術(shù)與宏基因組的聯(lián)合，基因組與蛋白質(zhì)組的聯(lián)合等。隨著技術(shù)的不斷完善，微生物群落功能研究必將邁出新的步伐，