人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則培訓(xùn)講學(xué)

1、人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則一、引言由于分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)及重組 DNA（ rDNA技術(shù)的迅速發(fā)展，現(xiàn)已 能夠確定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因， 將其插入表達(dá)載體或引入某種宿 主細(xì)胞后，能有效地表達(dá)該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化和檢定，可得到用于預(yù)防 和治療某些人類(lèi)疾病的制品，諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長(zhǎng)激素、干 擾素等。用不同于常規(guī)方法的rDNA技術(shù)生產(chǎn)的制品，是近年來(lái)出現(xiàn)的新產(chǎn)品，評(píng) 價(jià)其安全性和有效性亦不同于常規(guī)方法。這一領(lǐng)域中的知識(shí)和技術(shù)還在不斷發(fā) 展，為了有利于這類(lèi)制品在我國(guó)的研究和發(fā)展，并為這類(lèi)制品的審評(píng)提供依據(jù)， 有必要制定一個(gè)原則性指導(dǎo)文件，以保證在人群中試

2、驗(yàn)或應(yīng)用時(shí)安全有效。本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則”（以下簡(jiǎn)稱指導(dǎo)原則） 不可能面面俱到， 可能有許多專(zhuān)門(mén)技術(shù)問(wèn)題會(huì)出現(xiàn)， 對(duì)于這類(lèi)問(wèn)題或某一特定制 品，則應(yīng)視具體問(wèn)題具體研究決定。本指導(dǎo)原則亦將隨科學(xué)技術(shù)發(fā)展和經(jīng)驗(yàn) 積累而逐步完善。二、總則（一）本指導(dǎo)原則適用于rDNA技術(shù)生產(chǎn)并在人體內(nèi)應(yīng)用的蛋白質(zhì)、 肽類(lèi)制品。（二）凡屬與一般生物制品有關(guān)的質(zhì)量控制，均按現(xiàn)行版中國(guó)藥典 有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。 有關(guān)生產(chǎn)設(shè)施的要求應(yīng)參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局 藥品生產(chǎn)質(zhì)量 管理規(guī)范執(zhí)行。三、質(zhì)量控制要求（一）原材料的控制1 表達(dá)載體和宿主細(xì)胞應(yīng)提供有關(guān)表達(dá)載體詳細(xì)資料，包括基因的來(lái)源、克隆和鑒定，表達(dá)載 體的

3、構(gòu)建、 結(jié)構(gòu)和遺傳特性。 應(yīng)說(shuō)明載體組成各部分的來(lái)源和功能， 如復(fù)制子和 啟動(dòng)子來(lái)源，或抗生素抗性標(biāo)志物。提供至少包括構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜。 應(yīng)提供宿主細(xì)胞的資料，包括細(xì)胞株（系）名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及基本生物學(xué)特性等。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài) （是否整合 到染色體內(nèi)）及拷貝數(shù)。應(yīng)提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。2 克隆基因的序列應(yīng)提供插入基因和表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達(dá)有 關(guān)的序列均應(yīng)詳細(xì)敘述。3 表達(dá)應(yīng)詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)和控制克隆基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)所 采用的方法及表達(dá)水平。4原輔料 原輔料應(yīng)按照國(guó)家藥品監(jiān)督管

4、理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動(dòng)物源性原料的使用 應(yīng)提供來(lái)源及質(zhì)控檢測(cè)資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加B內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。（二）生產(chǎn)的控制1 主細(xì)胞庫(kù)（ MASTERCELLBA）NKrDNA制品的生產(chǎn)應(yīng)采用種子批（SEEDLOT系統(tǒng)。從已建立的主細(xì)胞庫(kù) 中，再進(jìn)一步建立生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)（ WC）B 。含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞應(yīng)經(jīng)過(guò)克隆而建立主細(xì)胞庫(kù)。在此過(guò)程中，在同 一實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)內(nèi)，不得同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞（菌種）；一個(gè)工作人員亦不得 同時(shí)操作兩種不同細(xì)胞或菌種。應(yīng)詳細(xì)記述種子材料的來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用壽命。應(yīng)提供在保 存和復(fù)蘇條件下宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。 采用新的種子批時(shí)， 應(yīng)重新作 全面檢定。真核細(xì)胞

5、用于生產(chǎn)時(shí)， 細(xì)胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征， 對(duì)鑒別所建立的種子是有用的。 有關(guān)所用傳代細(xì)胞的致癌性應(yīng)有詳細(xì)報(bào)告。 如采 用微生物培養(yǎng)物為種子，則應(yīng)敘述其特異表型特征。一般情況下，在原始種子階段應(yīng)確證克隆基因的 DNA序列。但在某些情 況下，例如傳代細(xì)胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對(duì)克隆基因作 DNA序列分析。在此情況下，可采用總細(xì)胞 DNA勺雜交印染分析，或作 mRN的 序列分析。對(duì)最終產(chǎn)品的特征鑒定應(yīng)特別注意。種子批不應(yīng)含有外源致癌因子，不應(yīng)含有感染性外源因子，如細(xì)菌、支 原體、真菌及病毒。有些細(xì)胞株含有某些內(nèi)源病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，且不易除去。但當(dāng)已 確知

6、在原始細(xì)胞庫(kù)或載體部分中污染此類(lèi)特定內(nèi)源因子時(shí)， 則應(yīng)能證明在生產(chǎn)純 化過(guò)程可使之滅活或清除。2 有限代次生產(chǎn)用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法應(yīng)有詳細(xì)資料。對(duì)培養(yǎng)過(guò)程及收 獲時(shí)，應(yīng)有敏感的檢測(cè)措施控制微生物污染。應(yīng)提供培養(yǎng)生長(zhǎng)濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并應(yīng)確立廢棄一批培養(yǎng) 物的指標(biāo)。 根據(jù)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料， 確定在生產(chǎn)過(guò)程中允許的最 高細(xì)胞倍增數(shù)或傳代代次，并應(yīng)提供最適培養(yǎng)條件的詳細(xì)資料。在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)，應(yīng)監(jiān)測(cè)宿主細(xì)胞載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)粒拷貝 數(shù)、宿主細(xì)胞中表達(dá)載體存留程度、 含插入基因的載體的酶切圖譜。 一般情況下， 用來(lái)自一個(gè)原始細(xì)胞庫(kù)的全量培養(yǎng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)， 必要時(shí)應(yīng)

7、做一次目的基因的核苷 酸序列分析。3 連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)基本要求同 2 項(xiàng)。應(yīng)提供經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)后所表達(dá)基因的分子完整性資料，以及宿主細(xì)胞的表 型和基因型特征。 每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應(yīng)在規(guī)定范圍內(nèi)。 對(duì)可以進(jìn)行后處理及應(yīng) 廢棄的培養(yǎng)物， 應(yīng)確定指標(biāo)。 從培養(yǎng)開(kāi)始至收獲， 應(yīng)有敏感的檢查微生物污染的 措施。根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及表達(dá)產(chǎn)物的恒定性資料，應(yīng)規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時(shí) 間。如屬長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)培養(yǎng)， 應(yīng)根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料， 在不同 間隔時(shí)間作全面檢定。4 純化對(duì)于收獲、分離和純化的方法應(yīng)詳細(xì)記述，應(yīng)特別注意污染病毒、核酸 以及有害抗原性物質(zhì)的去除。如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，應(yīng)有檢測(cè)可能污

8、染此類(lèi)外源 性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測(cè)出的異種免疫球蛋白。對(duì)整個(gè)純化工藝應(yīng)進(jìn)行全面研究，包括能夠去除宿主細(xì)胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過(guò)程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等。關(guān)于純度的要求可視制品的用途和用法而確定，例如，僅使用一次或需 反復(fù)多次使用；用于健康人群或用于重癥患者；對(duì)純度可有不同程度要求。（三）最終產(chǎn)品的控制 應(yīng)建立有關(guān)產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗(yàn)方法。檢測(cè) 的必要性和純度要求取決于多種因素： 產(chǎn)品性質(zhì)和用途、 生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn) 工藝的經(jīng)驗(yàn)。 一般說(shuō)來(lái)下列試驗(yàn)對(duì)控制產(chǎn)品質(zhì)量是可以采用的。 新的分析技術(shù)及 對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的改進(jìn)正在不斷進(jìn)行，適當(dāng)時(shí)應(yīng)使用這些新的技術(shù)

9、。1 物理化學(xué)鑒定（1）氨基酸組成 使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列 推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。 如需要時(shí)應(yīng)考慮分子量的大小。 多數(shù)情況 下，氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料， 但對(duì)大蛋白一般 意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。（2）氨基酸末端序列氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目 的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí)， 應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異 數(shù)量。應(yīng)將這些氨基酸末端序列與來(lái)自目的產(chǎn)品基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列 進(jìn)行比較。（3）肽譜 應(yīng)用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的產(chǎn)

10、品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽， 應(yīng)用 HPLC 或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍?應(yīng)盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測(cè) 序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對(duì)批簽發(fā)來(lái)說(shuō) ,經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn) 品結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。（4）巰基和二硫鍵 如果依據(jù)目的產(chǎn)品基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)， 應(yīng)盡可能確定巰基和 /或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜 測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā＃?）碳水化合物結(jié)構(gòu)應(yīng)測(cè)定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長(zhǎng)鏈狀）和多肽的糖基化位點(diǎn)（6）分子量應(yīng)用分子篩層析法、SDS-PAGE還原和/或非

11、還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法、 和 / 或其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量。（ 7 ）等電點(diǎn)通過(guò)等電聚焦電泳或其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。（8）消光系數(shù)（或克分子吸光度）多數(shù)情況下，可取目的產(chǎn)品于 UV/可見(jiàn)光波長(zhǎng)處測(cè)定消光系數(shù)（或克分 子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用 UV/可見(jiàn)光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量 的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。（ 9 ）電泳圖型應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SD&PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法 或其他適當(dāng)?shù)姆椒?,獲得目的產(chǎn)品 /藥物的一致性 ,同一性和純度的電泳圖譜和數(shù) 據(jù)。（10）液相層析圖譜 應(yīng)用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層

12、析或其他適當(dāng)方法，獲得目的產(chǎn)品 /藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。（11）光譜分析 適當(dāng)時(shí)，應(yīng)用紫外或可見(jiàn)光吸收光譜法測(cè)定，使用圓二色譜、核磁共振（NMR、或其他適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)制品的高級(jí)結(jié)構(gòu)。2 雜質(zhì)檢測(cè)（ 1 ）工藝相關(guān)雜質(zhì) 工藝相關(guān)雜質(zhì)來(lái)源于生產(chǎn)工藝，可分三大類(lèi)：來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基 和下游工藝。 來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白 /多肽；核酸（宿主 細(xì)胞/載體/總DNA ；多糖及病毒。對(duì)于宿主細(xì)胞蛋白，一般應(yīng)用能檢測(cè)出較寬 范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測(cè)方法。 應(yīng)用不含目的基因的生物體粗提物， 即不 含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細(xì)胞， 制備上述試驗(yàn)使用的多克隆抗體。 可

13、通過(guò)對(duì)產(chǎn)品 的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測(cè)宿主細(xì)胞的DNA水平，和/或通過(guò)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)室規(guī)模）檢測(cè)證實(shí)通過(guò)純化工藝能去除核酸。對(duì)于有意導(dǎo)入的病毒，應(yīng) 驗(yàn)證生產(chǎn)工藝中去除 / 滅活病毒的能力。 來(lái)源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及 其他培養(yǎng)基組分。 來(lái)源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、 胍、氧化劑和還原劑）、無(wú)機(jī)鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載 體/ 配體（如單克隆抗體），及其他可濾過(guò)的物質(zhì)。（ 2）產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì) 以下為最常見(jiàn)的目的產(chǎn)品的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測(cè)方法： 化學(xué)修飾類(lèi)型：應(yīng)考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯(cuò)配 S-S連接

14、和氧化形式的 分離和鑒別。 對(duì)這些變異體的分離和鑒別， 可應(yīng)用層析法和 /或電泳法（如 HPLC、 毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。 降解物和聚合體： 聚合體包括二聚體和多聚體： 可用分子篩層析法 （如SE-HPLC進(jìn)行定量；降解物：應(yīng)建立降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)生 的降解產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。3 生物學(xué)測(cè)定（ 1）鑒別試驗(yàn)應(yīng)用免疫印跡法，或者在可能情況下，應(yīng)用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn) 品通過(guò)生物學(xué)比較試驗(yàn)，確定其與天然產(chǎn)品是一致的。（ 2 ）效價(jià)測(cè)定采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或經(jīng)過(guò)國(guó)家檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參考品，以體內(nèi)或 體外法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位。（3）特異比活性測(cè)定 在測(cè)定

15、生物學(xué)活性的基礎(chǔ)上，對(duì)有些制品還應(yīng)用適當(dāng)方法測(cè)定主藥蛋白含量，測(cè)定其特異比活性，以活性單位重量表示。（4）熱原質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)采用家兔法或鱟試驗(yàn)法（LAL）作熱原質(zhì)檢測(cè)，控制標(biāo)準(zhǔn)可參照天然制 品的要求。（ 5）無(wú)菌試驗(yàn) 參照現(xiàn)行版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，應(yīng)證實(shí)最終制品無(wú)細(xì)菌污染。（ 6）抗原性物質(zhì)檢查必要時(shí)，如制品屬大劑量反復(fù)使用者，應(yīng)測(cè)定最終制品中可能存在的抗 原性物質(zhì)，如宿主細(xì)胞、 亞細(xì)胞組分及培養(yǎng)基成份等。 患者反復(fù)接受大劑量的這 類(lèi)制品時(shí)，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反應(yīng)。（7）異常毒性試驗(yàn) 可參照現(xiàn)行版中國(guó)藥典有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。4 其他根據(jù)產(chǎn)品劑型， 應(yīng)有外觀（如固體、液體、色澤、澄明

16、度等方面的描述） 、 水分、PH值、裝量等方面的規(guī)定，可參照現(xiàn)行版中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。四、臨床前安全性評(píng)價(jià) 臨床前安全性試驗(yàn)的目的主要是確定新制品是否會(huì)在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)。但是，用于一般化學(xué)藥物的傳統(tǒng)安全性或毒性試驗(yàn)對(duì)rDNA產(chǎn)品不一定適用，用傳統(tǒng)毒性試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)rDNA產(chǎn)品往往有困難，并受多種因素的影響。 例如，某些蛋白質(zhì)，如干擾素，具有高度種屬特異性，這種人的蛋白質(zhì)對(duì)人的藥 理學(xué)活性遠(yuǎn)高于對(duì)動(dòng)物的活性， 而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列， 常常與來(lái)自其它種 系的蛋白質(zhì)不同， 例如糖基就不一樣。 因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽 類(lèi)往往會(huì)在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答， 其生物學(xué)效應(yīng)有所改變， 并可 能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)， 而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯 然無(wú)關(guān)。另外，由于產(chǎn)品效價(jià)、生產(chǎn)