內(nèi)膜系統(tǒng)與膜運(yùn)輸4

1、9.5.2 吞噬作用與內(nèi)吞作用(endocytosis)細(xì)胞通過胞吐作用將細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞外,又通過內(nèi)吞作用將細(xì)胞外的營養(yǎng)物質(zhì)等攝取到細(xì)胞內(nèi)以維持正常的代謝活動。細(xì)胞的內(nèi)吞有兩種類型, 一種是吞噬細(xì)胞完成的對有害物質(zhì)的吞噬, 另一種類型是通過細(xì)胞質(zhì)膜受體介導(dǎo)的對細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)的內(nèi)吞。Æ吞噬作用(phagocytosis)又稱胞吃作用(cellular eating)。吞噬作用只限于幾種特殊的細(xì)胞類型，如變形蟲(Amoebae)和一些單細(xì)胞的真核生物通過吞噬作用從周圍環(huán)境中攝取營養(yǎng)。在大多數(shù)高等動物細(xì)胞中, 吞噬作用是一種保護(hù)措施而非攝食的手段。高等動物具有一些特化的吞噬細(xì)胞,

2、包括巨噬細(xì)胞(macrophages)和中性粒細(xì)胞(neutrophils)。它們通過吞噬菌體攝取和消滅感染的細(xì)菌、病毒以及損傷的細(xì)胞、衰老的紅細(xì)胞(圖9-55)。 圖9-55 巨噬細(xì)胞正在吞噬衰老的紅細(xì)胞 Æ吞飲作用(pinocytosis)又稱胞飲作用(cellular drinking), 胞吞作用的一種類型。它是一種非選擇性的連續(xù)攝取細(xì)胞外基質(zhì)中液滴的內(nèi)吞過程。吞入的物質(zhì)通常是液體或溶解物。所形成的小囊泡的直徑小于150nm。根據(jù)細(xì)胞外物質(zhì)是否吸附在細(xì)胞表面，將胞飲作用分為兩種類型:液相內(nèi)吞(fluid-phase endocytosis)和吸附內(nèi)吞(absorption e

3、ndocytosis)。Æ受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(receptor-mediated endocytosis)一種特殊類型的內(nèi)吞作用，主要是用于攝取特殊的生物大分子。Ä吞入的物質(zhì)大約有50種以上的不同蛋白，包括激素、生長因子、淋巴因子和一些營養(yǎng)物都是通過這種方式進(jìn)入細(xì)胞(表9-9)。表9-9通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞的配體激素(hormones)胰島素(insulin)黃體生成素(luteinizing hormone,LH)促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)生長激素(growth hormone)催乳素(prolactin)生長

4、因子(growth factors)表皮生長因子(epidermal growth factor)血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor)轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor) 神經(jīng)生長因子(nerve growth factor)淋巴因子(lymphokines)白細(xì)胞介素(interleukins)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)干擾素(interferon)集落刺激因子(colony stimulating factor)營養(yǎng)物(nutrients)低密度脂蛋白(LDL，cholestero

5、l)轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，iron)Ä配體(ligand)同受體結(jié)合的物質(zhì)稱為配體(ligand)。配體可分為四大類:.營養(yǎng)物, 如轉(zhuǎn)鐵蛋白、低密度脂蛋白(LDL)等; .有害物質(zhì), 如某些細(xì)菌; .免疫物質(zhì), 如免疫球蛋白、抗原等; .信號物質(zhì), 如胰島素等多種肽類激素等。Ä 受體介導(dǎo)內(nèi)吞的基本特點(diǎn)有兩個特點(diǎn): 配體與受體的結(jié)合是特異的, 具有選擇性; 要形成特殊包被的內(nèi)吞泡。將成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在加有轉(zhuǎn)鐵蛋白-鐵標(biāo)記的低密度脂蛋白(LDL)的培養(yǎng)基中,可清楚地觀察到這一過程(圖9-56)。 圖9-56 低密度的脂蛋白(LDL)經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的起始階段的電鏡

6、照片圖中所示是培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞質(zhì)膜對LDL的內(nèi)吞作用。LDL顆粒與含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白共價相連, 電子顯微鏡下所見的黑點(diǎn)是小分子的鐵。(a)LDL與細(xì)胞表面的受體結(jié)合并形成有網(wǎng)格蛋白包被的小窩;(b) 含有LDL的被膜小窩向下凹陷逐漸形成被膜小泡;(c) 含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的LDL被膜小泡;(d)含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的LDL顆粒的無被小泡(初級內(nèi)體)。Ä基本過程大致分為四個基本過程配體與膜受體結(jié)合形成一個小窩(pit); 小窩逐漸向內(nèi)凹陷，然后同質(zhì)膜脫離形成一個被膜小泡; 被膜小泡的外被很快解聚, 形成無被小泡, 即初級內(nèi)體; 初級內(nèi)體與溶酶體融合,吞噬的物質(zhì)被溶酶體的酶水解(圖9-57)。 圖

7、9-57 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用什么是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用?有什么特點(diǎn)國? 基本過程怎樣?Æ 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞泡的命運(yùn)在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中,隨內(nèi)吞泡進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)可分為三大類配體(獵物)、受體和膜組分, 它們進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)如何呢? Ä配體和受體的命運(yùn)在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞中,配體基本被降解, 少數(shù)可被利用。大多數(shù)受體能夠再利用, 少數(shù)受體被降解。通常受體有四種可能的去向(圖9-58)。Ä膜成分的命運(yùn)被內(nèi)吞進(jìn)來的膜成分有三種可能的去向(圖9-58)。 圖9-58 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用所涉及的途徑受體介導(dǎo)的內(nèi)吞中, 內(nèi)吞泡中的配體、受體和膜成分的去向如何?Æ受體介導(dǎo)的

8、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)內(nèi)吞作用ÄLDL的結(jié)構(gòu)LDL是一種球形顆粒的脂蛋白(圖9-59)，直徑為22nm, 核心是1500個膽固醇酯；外面由800個磷脂和500個未酯化的膽固醇分子包裹,由于外被脂分子的親水頭露在外部，使LDL能夠溶于血液中；最外面有一個分子量為55 kDa的蛋白，叫輔基蛋白B100(apolipoprotein B-100), 它能夠與特定細(xì)胞的表面受體結(jié)合。 圖9-59 LDL顆粒結(jié)構(gòu)示意圖(a)由磷脂和未酯化的膽固醇單層構(gòu)成LDL的外膜結(jié)構(gòu), 在外膜上結(jié)合一個親水的apo-B蛋白,該蛋白可以介導(dǎo)LDL與細(xì)胞表面的受

9、體結(jié)合。(b)四種類型脂蛋白的電鏡照片ÄLDL受體蛋白LDL受體蛋白是一個單鏈的糖蛋白,由839個氨基酸組成,跨膜區(qū)由22個疏水的氨基酸組成,為單次跨膜蛋白。LDL受體蛋白合成后被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜,即使沒有相應(yīng)配體的存在, LDL受體蛋白也會在細(xì)胞質(zhì)膜集中濃縮并形成被膜小窩,當(dāng)血液中有LDL顆粒,可立即與LDL的apoB-100結(jié)合形成LDL-受體復(fù)合物。ÄLDL的內(nèi)吞一旦LDL與受體結(jié)合,就會形成被膜小泡被細(xì)胞吞入，接著是網(wǎng)格蛋白解聚, 受體回到質(zhì)膜再利用, 而LDL被傳送給溶酶體, 在溶酶體中蛋白質(zhì)被降解, 膽固醇被釋放出來用于質(zhì)膜的裝配, 或進(jìn)入其他代謝途徑(9-60)

10、。 圖9-60 受體介導(dǎo)的LDL內(nèi)吞過程 簡述LDL經(jīng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被吞入細(xì)胞和被利用過程。ÄLDL與HDL的關(guān)系LDL不是血液中惟一的膽固醇運(yùn)輸劑, HDL也有類似的結(jié)構(gòu)和功能, 但含有不同的蛋白質(zhì)具有不同的生理作用。LDL主要是將肝組織的膽固醇運(yùn)向身體其他部位的細(xì)胞。而HDL則沿相反方向運(yùn)輸,即從身體其他部位將膽固醇運(yùn)向肝組織,通過內(nèi)吞作用被吸收并作為膽汁分泌出去。血液中LDL的升高會增加心臟病的危險性,但是血液中HDL的水平提高就會降低這種危險性,因?yàn)樗梢酝ㄟ^肝來降低血液中的LDL水平。ÄLDL與動脈粥樣硬化血液中LDL的水平與動脈粥樣硬化(動脈變窄)有極大的關(guān)

11、系。動脈阻塞是一個復(fù)雜的、尚不十分清楚的過程, 其中也包括血管內(nèi)壁含有LDL血斑的沉積。動脈粥樣硬斑不僅降低血液流通,也是血凝塊形成的部位, 它可阻塞血管中血液的流通。在冠狀動脈中形成的血凝塊會導(dǎo)致心肌梗塞。LDL受體缺陷是造成血液中LDL水平升高的主要原因。什么是低密度脂蛋白(LDL), 與動脈粥樣硬化(動脈變窄)有什么關(guān)系?Æ 鐵離子的內(nèi)吞運(yùn)輸鐵是細(xì)胞內(nèi)的金屬離子, 對細(xì)胞的生命活動具有重要作用, 它是通過轉(zhuǎn)鐵蛋白和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被輸入細(xì)胞的。Ä轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)轉(zhuǎn)鐵蛋白是細(xì)胞中鐵結(jié)合蛋白, 負(fù)責(zé)將肝組織(是鐵貯藏的主要場所)和腸組織的鐵向其它細(xì)胞的

12、運(yùn)輸。沒有結(jié)合鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白稱作脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白(apotransferrin), 它能夠緊緊結(jié)合兩個Fe3+, 此時稱為鐵結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白(ferrotransferrin)。Ä鐵的運(yùn)輸所有生長中的細(xì)胞表面都有鐵結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體,在中性pH條件下與鐵結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白與鐵結(jié)合, 然后通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi),在內(nèi)體的酸性環(huán)境中, 轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放出鐵, 但是轉(zhuǎn)鐵蛋白仍然同膜受體結(jié)合, 并與受體一起回到質(zhì)膜；當(dāng)細(xì)胞外環(huán)境變成中性時, 轉(zhuǎn)鐵蛋白同受體脫離,并自由地結(jié)合鐵, 然后又開始新一輪循環(huán)。實(shí)際上, 轉(zhuǎn)鐵蛋白穿梭于細(xì)胞外液體和內(nèi)體之間, 避開了溶酶體, 快速傳遞細(xì)胞生長所需的鐵(圖9-61)。

13、 圖9-61 生長細(xì)胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白的循環(huán)Æ轉(zhuǎn)胞吞作用(transcytosis)轉(zhuǎn)胞吞作用是一種特殊的內(nèi)吞作用，受體和配體在內(nèi)吞中并未作任何處理,只是經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到相反的方向, 然后通過胞吐作用, 將內(nèi)吞物釋放到細(xì)胞外,這種內(nèi)吞主要發(fā)生在極性細(xì)胞中,如抗體轉(zhuǎn)運(yùn)到血液和奶汁就是這種運(yùn)輸(圖9-62)。 圖9-62 母體IgG免疫球蛋白跨過新生鼠表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)胞吞作用 配體跨細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)同時涉及胞吞作用與胞吐作用。在新生的小鼠中, 腸腔內(nèi)的pH=6,而表皮的相對一側(cè)(朝向血管)的pH=7,表皮細(xì)胞質(zhì)膜上的Fc受體在pH=6或更低時與IgG的Fc結(jié)合, 在pH=7時不能結(jié)合。在腔面形成的含有Fc

14、受體-IgG復(fù)合物的內(nèi)吞體跨細(xì)胞移動并與基膜融合,釋放出IgG,卸載的受體通過轉(zhuǎn)胞吞作用回到原來的質(zhì)膜。9.6 小泡運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)理(molecular mechanism of vesicular traffic)膜結(jié)合核糖體合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后的運(yùn)輸是通過小泡轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)的,其機(jī)理涉及三個基本問題:小泡是怎樣形成的? 不同類型小泡如何準(zhǔn)確到達(dá)作用部位? 小泡與細(xì)胞質(zhì)膜、小泡與小泡之間是怎樣融合的?9.6.1 運(yùn)輸小泡的類型和分選信號在細(xì)胞分泌和內(nèi)吞過程中,從膜上形成的小泡通常由不同的蛋白質(zhì)包被，因此稱為被膜小泡(coated vesicles), 有三種類型的被膜小泡(圖9-63)。 圖9-

15、63 在細(xì)胞分泌和內(nèi)吞途徑中三種類型的被膜小泡及運(yùn)輸途徑Æ分泌小泡的類型Ä披網(wǎng)格蛋白小泡(clathrin-coated vesicle)由網(wǎng)格蛋白形成的被膜小泡, 介導(dǎo)從反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)到細(xì)胞質(zhì)膜、從細(xì)胞質(zhì)膜到反面高爾基網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)輸。從高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)形成的披網(wǎng)格蛋白小泡與從細(xì)胞質(zhì)膜形成的披網(wǎng)格蛋白小泡所用的銜接蛋白(adaptin)是不同的。 在披網(wǎng)格蛋白小泡形成過程中, 網(wǎng)格蛋白同膜受體結(jié)合, 形成被膜小窩, 并逐漸使被膜小窩下陷, 最后同膜脫離形成一個包有網(wǎng)格蛋白外被的小泡。據(jù)估計(jì), 在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中, 每分鐘大約有2500個披網(wǎng)格蛋白小泡從質(zhì)膜上脫離下來。

16、96;COP被膜小泡(COP coated vesicle)這種類型的小泡是介導(dǎo)非選擇性運(yùn)輸?shù)男∨? 它參與從ER到順面高爾基體、從順面高爾基體到高爾基體中間膜囊、從中間膜囊到反面高爾基體的運(yùn)輸。這種小泡的外被是外被蛋白COP(coat protein,COP)，外被蛋白是一個大的復(fù)合體，稱為外被體(coatomer)，ÄCOP被膜小泡(COPcoated vesicle),主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)從高爾基體運(yùn)回內(nèi)質(zhì)網(wǎng),包括從反面高爾基體運(yùn)向順面高爾基體,以及將蛋白質(zhì)從反面高爾基體運(yùn)回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種類型的運(yùn)輸小泡介導(dǎo)不同途徑的運(yùn)輸,但還不清楚組成型運(yùn)輸小泡是如何包被的。三種不同小

17、泡雖然有很多差異,但在小泡形成的方式和所需的成份基本一致(圖9-64)。 圖9-64 參與被膜小泡出芽形成的一些組分 出芽形成被膜小泡時需要小GTP結(jié)合蛋白、外被體和銜接蛋白、膜受體蛋白等。Ä三種類型小泡間的差異三種類型小泡不僅外被蛋白不同, 小泡形成時所需的小GTP結(jié)合蛋白和銜接蛋白也不相同(表9-10)。 表9-10 三種不同類型小泡的外被蛋白、銜接蛋白及運(yùn)輸路線 小GTP結(jié)小泡類型 外被和銜接蛋白 合蛋白 運(yùn)輸方向網(wǎng)格蛋白 網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈,AP2 ARF 質(zhì)膜內(nèi)體(內(nèi)吞作用) 網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈,AP1 ARF Golgi內(nèi)體 網(wǎng)格蛋白重鏈和輕鏈,AP3 ARF Golgi

18、溶酶體、液泡、 黑色體、血小板小泡COP COP , ARF GolgiER 高爾基體膜囊間的回運(yùn) COP Sec23/Sec24復(fù)合物; Sar1 ERGolgi Sec13/Sec31復(fù)合物;Sec16Æ小泡運(yùn)輸?shù)姆诌x信號三種不同類型運(yùn)輸小泡的形成和定向運(yùn)輸都是由信號指導(dǎo)的。如KDEL信號是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的滯留信號, 因此KDEL是COP型小泡形成的信號。小泡形成不僅需要信號,同時也需要銜接蛋白和信號受體,表9-11綜合了三種類型運(yùn)輸小泡的一些信號、受體和銜接分子。 表9-11 分泌蛋白與膜蛋白經(jīng)小泡運(yùn)輸?shù)姆诌x信號 蛋白質(zhì) 信號序列* 的類型 運(yùn)輸方向 小泡類型 信號受體Lys-As

19、p-Glu-Leu(KDEL) 分泌蛋白 GolgiER COPI 位于高爾基體的 KDEL受體(ERD2 蛋白)Lys-Lys-X-X(KKXX) 膜蛋白 GolgiER COPI COP和亞基二酸性(如Asp-X-Glu) 膜蛋白 ERGolgi COP 未知M6P 分泌蛋白 反面高爾基體 網(wǎng)格蛋白 反面高爾基體 和質(zhì)膜向次級 和質(zhì)膜中M6P 內(nèi)體 受體,AP1和 AP2銜接蛋白Tyr-X-X-(YXX) 膜蛋白 質(zhì)膜內(nèi)體 網(wǎng)格蛋白 AP2銜接蛋白 Leu-Leu(LL) 膜蛋白 質(zhì)膜內(nèi)體 網(wǎng)格蛋白 AP2銜接蛋白注:X=任何氨基酸, =各種疏水氨基酸;括號中單字母表示氨基酸的單字母縮寫,

20、而非括號中的單字母不僅表示氨基酸縮寫,也表示是膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。9.6.2 披網(wǎng)格蛋白小泡形成的機(jī)理在大量進(jìn)行內(nèi)吞活動的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)中,細(xì)胞質(zhì)膜有許多網(wǎng)格蛋白小窩(圖9-65)。這些小窩的形成需要很多銜接子(adapter)和網(wǎng)格蛋白,小泡最后與質(zhì)膜的脫離還需要一種稱作發(fā)動蛋白(dynamin)的GTP結(jié)合蛋白。圖9-65 成纖維細(xì)胞質(zhì)面的網(wǎng)格蛋白被膜小窩的電子顯微鏡照片Æ網(wǎng)格蛋白(clathrin)及包被亞基(coat subunits)典型的披網(wǎng)格蛋白小泡的直徑為50100nm。網(wǎng)格蛋白由分子量為180kDa的重鏈和分子量為3540kDa的輕鏈組成二聚體, 三

21、個二聚體形成包被的基本結(jié)構(gòu)單位-三聯(lián)體骨架(triskelion), 稱為三腿蛋白(three-legged protein)。許多三腿復(fù)合物再組裝成六邊形或五邊形網(wǎng)格結(jié)構(gòu),即包被亞基,然后由這些網(wǎng)格蛋白亞基組裝成披網(wǎng)格蛋白小泡(圖9-66)。 圖9-66 網(wǎng)格蛋白的結(jié)構(gòu) (a) 網(wǎng)格蛋白的三腿復(fù)合物;(b)網(wǎng)格蛋白包被亞基;(c)披網(wǎng)格蛋白小泡。Æ銜接蛋白(adaptin, AP) 和發(fā)動蛋白(dynamin)Ä銜接蛋白在網(wǎng)格蛋白被膜小窩形成時, 網(wǎng)格蛋白和膜之間有一種蛋白質(zhì)起銜接作用,這就是銜接蛋白。所以銜接蛋白是一種在披網(wǎng)格蛋白小泡形成中起中介作用的蛋白質(zhì)(圖9-67

22、)。 圖9-67 銜接蛋白與膜受體細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的信號序列相互作用 目前已知有三種銜接蛋白:AP1、AP2和AP3。AP1: 銜接蛋白AP1參與反面高爾基體的披網(wǎng)格蛋白小泡的出芽。由于M6P受體蛋白既存在于反面高爾基體又存在于細(xì)胞質(zhì)膜,所以這種受體既能同AP1作用又能與AP2相互作用。AP2: 銜接蛋白AP2是由銜接蛋白(鏈)和銜接蛋白(鏈)兩種銜接蛋白組成的異二聚體。參與反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)的披網(wǎng)格蛋白小泡的組裝。AP3: 最近在酵母和鼠的研究中又鑒定了一種銜接蛋白：AP3，具有AP3突變的酵母,反面高爾基體的某些蛋白就不能被運(yùn)輸?shù)揭号?、溶酶體。什么是銜接蛋白? 在小泡裝配中起什么作用?

23、6;發(fā)動蛋白發(fā)動蛋白是一種胞質(zhì)溶膠蛋白,有900個氨基酸, 能夠同GTP結(jié)合并將GTP水解。發(fā)動蛋白的作用是在被膜小窩的頸部聚合,通過水解GTP調(diào)節(jié)自己收縮, 最后將小泡與質(zhì)膜割開。Æ披網(wǎng)格蛋白小泡的形成和運(yùn)輸披網(wǎng)格蛋白小泡的形成分為三個基本過程Ä被膜小窩(clathrin-coated pit)的形成網(wǎng)格蛋白被膜小窩是披網(wǎng)格蛋白小泡形成過程中的一個中間體。在胞吞過程中, 吞入物(配體)先同膜表面特異受體結(jié)合, 然后網(wǎng)格蛋白裝配的亞基結(jié)合上去, 使膜凹陷成小窩狀。由于這種小窩膜外側(cè)結(jié)合有許多網(wǎng)格蛋白, 故稱為網(wǎng)格蛋白被膜小窩。Ä披網(wǎng)格蛋白小泡的形成在形成了網(wǎng)格蛋白

24、被膜小窩之后, 很快通過出芽的方式形成小泡，即披網(wǎng)格蛋白小泡, 小泡須在發(fā)動蛋白的作用下與質(zhì)膜割離。由于此時的小泡外面有網(wǎng)格蛋白包被, 故稱為被膜小泡。Ä無被小泡的形成披網(wǎng)格蛋白小泡形成之后, 很快脫去網(wǎng)格蛋白的外被, 成為無被小泡。在真核細(xì)胞中有一種分子伴侶Hsc70催化披網(wǎng)格蛋白小泡的外被去聚合形成三腿復(fù)合物, 并重新用于披網(wǎng)格蛋白小泡的裝配。披網(wǎng)格蛋白小泡形成的過程示于圖9-68。 圖9-68 披網(wǎng)格蛋白小泡的形成過程。 ÄCa2+參與了披網(wǎng)格蛋白小泡包被的形成和去被的過程。在形成包被時, 鈣泵將Ca2+泵出細(xì)胞外, 使胞質(zhì)中的Ca2+保持低濃度, 有利于有被小窩的形

25、成。一旦形成被膜小泡, Ca2+同網(wǎng)格蛋白的輕鏈結(jié)合, 使包被不穩(wěn)定而脫去。簡要敘述披網(wǎng)格蛋白小泡形成和運(yùn)輸?shù)幕具^程及參與的因子9.6.3 COP-被膜小泡形成的機(jī)理COP-被膜小泡介導(dǎo)的是非選擇性的小泡運(yùn)輸, 包括從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體潴泡、從一個潴泡到另一個潴泡、到反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)以及從反面高爾基體向ER的回運(yùn)。Æ小GTP結(jié)合蛋白(small GTP binding protein) 小GTP結(jié)合蛋白是細(xì)胞內(nèi)的一個大的蛋白家族, 它以兩種狀態(tài)存在: 同GTP結(jié)合時, 具活性狀態(tài); 同GDP結(jié)合, 則是非活性狀態(tài)。小GTP結(jié)合蛋白的活性和非活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于兩種蛋白: 一種是鳥嘌呤

26、核苷釋放蛋白(guanine-nucleotide-releasing protein, GNRP), 它催化GDP同GTP的交換。另一種是GTP 酶激活蛋白(GTPase-activating protein, GAP), 它觸發(fā)結(jié)合的GTP水解。在COP-被膜小泡的形成中小G蛋白起重要作用。Æ裝配反應(yīng)因子及COP被膜小泡的形成Ä裝配反應(yīng)因子(assembly reaction factor, ARF)裝配反應(yīng)因子被認(rèn)為是外被體外被的裝配和去裝配的信號。ARF是一種單體GTPase。當(dāng)ARF同GDP結(jié)合時，游離存在于胞質(zhì)溶膠中；若同GTP結(jié)合，GTP使ARF的構(gòu)型發(fā)生改變

27、，暴露出它的脂肪酸鏈，并隨即插入到供體膜中。同膜結(jié)合后的ARFGTP可以同外被體結(jié)合，形成被膜小泡。Ä外被體蛋白質(zhì)(coatmer protein, COP)COP是一種胞質(zhì)溶膠蛋白質(zhì)復(fù)合物,由7個亞基組成:、。COP在出芽小泡的胞質(zhì)溶膠面聚合, 形成COP被膜小泡。由COP作為外被的小泡稱為COP 被膜小泡。ÄCOP被膜小泡的形成 通過無細(xì)胞系統(tǒng)研究了COP運(yùn)輸小泡的出芽過程(圖9-69)： 一種胞質(zhì)溶膠中的小分子GTP結(jié)合蛋白,即ARF,釋放所結(jié)合的GDP,然后同GTP結(jié)合,形成ARF-GTP復(fù)合物,并整合在高爾基體膜中。GDP與GTP的交換是由高爾基體膜中的一種酶催化

28、的； COP同ARF以及高爾基體膜蛋白的細(xì)胞質(zhì)部分結(jié)合；在脂酰CoA(fatty-acyl CoA)的幫助下形成COP被膜小泡,但脂酰CoA的確切作用尚不清楚。一旦COP小泡形成就立即從供體膜釋放出來，COP包被去聚合, 并與膜脫離, 這一過程是由與ARF結(jié)合的GTP水解所觸發(fā)。 圖9-69 COP被膜小泡形成的過程 在高爾基體膜中一種酶的催化下,ARF蛋白將所結(jié)合的GDP與GTP進(jìn)行交換,出芽隨即開始。ARF-GTP與高爾基體膜中ARF受體結(jié)合后,外被體與高爾基體的胞質(zhì)溶膠面結(jié)合并聚合成纖維狀外被體,誘導(dǎo)出芽形成小泡。在出芽形成小泡過程中,不僅將被運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)包進(jìn)小泡,也包括其他一些膜蛋白,其

29、中包括V-SNARE,它的作用是導(dǎo)航,指引小泡到達(dá)正確的目的地。脂酰CoA幫助小泡與供體膜脫離,隨著GTP的水解小泡的外被解聚。ÄCOP被膜小泡介導(dǎo)的運(yùn)輸方向前面討論過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留蛋白都有KDEL信號, 如果錯誤輸出到高爾基體,則由位于高爾基體膜囊中的KDEL受體識別并與之結(jié)合。這種受體又是如何被COP識別并包裝進(jìn)入COP小泡? 研究發(fā)現(xiàn), KDEL受體的細(xì)胞質(zhì)面有Lys-Lys-X-X序列作為COP的識別信號。同樣,其他要回運(yùn)到ER的蛋白的細(xì)胞質(zhì)面都有這種信號。由此推測, COP被膜小泡介導(dǎo)的運(yùn)輸方向是從高爾基體到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的回流。ÆCOP小泡的形成Ä 外被體蛋白(C

30、OP)COP小泡介導(dǎo)從ER到高爾基體的運(yùn)輸,所以小泡首先是從ER形成的,其外被蛋白與COP相似但不相同,故稱為COP被膜小泡。COP也是多亞基的蛋白復(fù)合物, 構(gòu)成的亞基有Sec23/Sec24、Sec13/Sec31和Sec16等。Ä COP被膜小泡的裝配COP小泡的裝配需要一種稱為Sar1的G蛋白的參與。當(dāng)Sar1中GDP與GTP進(jìn)行了交換, 誘導(dǎo)Sec23和Sec24蛋白的結(jié)合,接著是Sec13和Sec31蛋白的結(jié)合,最后由一種結(jié)合在ER表面的大蛋白質(zhì),Sec16與Sec23/Sec24復(fù)合物、Sec13/Sec31復(fù)合物相互作用,裝配成一個完整的小泡。Ä識別信號在CO

31、P的小泡膜上有一個分子量為24kDa的蛋白質(zhì)幫助選擇被運(yùn)輸?shù)目扇苄缘腅R蛋白。COP小泡裝配時的識別信號是雙酸性分選信號(di-acidic sorting signal), 如Asp-X-Glu。這種信號序列與COP的一個或多個亞基結(jié)合。另外,從ER形成的COP小泡常常相互融合成大的運(yùn)輸小泡,這種大的小泡需要以微管作為運(yùn)輸軌道向高爾基體運(yùn)輸。9.6.4 小泡的定向運(yùn)輸、?？亢腿诤蠙C(jī)理無論是選擇性還是非選擇性的運(yùn)輸小泡, 它們都必須高度選擇性地有方向地到達(dá)目的地,那么定向運(yùn)輸和停泊的標(biāo)志是什么呢? 到達(dá)目的地后如何停泊?各種小泡都是膜封閉的結(jié)構(gòu)，它們又是怎樣突破膜結(jié)構(gòu)的障礙釋放出內(nèi)含物?

32、98;運(yùn)輸小泡尋靶: SNARE 假說James Rothman和他的同事根據(jù)對動物細(xì)胞融合研究的發(fā)現(xiàn)提出有關(guān)小泡尋靶的SNARE 假說(SNARE hypothesis)。ÄNSF和SNAPs他們發(fā)現(xiàn)動物細(xì)胞融合需要一種可溶性的細(xì)胞質(zhì)蛋白,叫做N-乙基馬來酰亞胺敏感的融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein,NSF)以及其它幾種可溶性的NSF附著蛋白(soluble NSF attachment protein,SNAPs)。NSF是一種四聚體，四個亞基都相同。SNAPs 有-、-和- SNAPs等。ÄSNARE 假說由

33、于NSF/ SNAPs能夠介導(dǎo)不同類型小泡的融合,說明它沒有特異性。據(jù)此Rothman提出一種假說:膜融合的特異性是由另外的膜蛋白提供的，把這種蛋白稱為SNAP受體蛋白(SNAP receptors)，或稱為SNAREs，這種蛋白可以作為膜融合時SNAPs的附著點(diǎn)。Ä不同的小泡具有不同的SNAREs按照Rothman的SNARE假說，每一種運(yùn)輸小泡都有一個特殊的V-SNARE(vesicle-SNAP receptor)標(biāo)志，能夠同適當(dāng)?shù)陌心ど系腡-SNARE(target-SNAP receptor)標(biāo)志相互作用。一種運(yùn)輸小泡在沒有找到合適的靶位點(diǎn)之前有可能同幾種不同的膜位點(diǎn)進(jìn)行過

34、暫時性地接觸，這種接觸是不穩(wěn)定的，只有找到真正的靶位點(diǎn)才會形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(圖9-70)。 圖9-70 運(yùn)輸小泡尋靶 不同的小泡上具有不同的V-SNARE, 它能識別不同靶膜上的T-SNARE并與之結(jié)合,以此保證運(yùn)輸小泡到達(dá)正確的目的地。 什么是小泡尋靶的SNARE假說? 提出的依據(jù)是什么?Æ Rab蛋白(Rab protein)在小泡運(yùn)輸與融合中的調(diào)節(jié)作用 Rab蛋白家族是真核細(xì)胞中控制小泡轉(zhuǎn)運(yùn)的GTP結(jié)合蛋白。ÄRab蛋白是一類調(diào)節(jié)型的單體GTPase, 所有的Rab蛋白都是由大約200個氨基酸組成的,并且有類似于Ras蛋白的重疊結(jié)構(gòu)。它能夠結(jié)合GTP并將GTP水解,因此

35、認(rèn)為Rab蛋白通過GTP的循環(huán)來調(diào)節(jié)小泡的融合(圖9-71)。 圖9-71 Rab蛋白的結(jié)構(gòu)ÄRab蛋白在小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)和融合中的調(diào)節(jié)機(jī)理可能是：供體膜上的鳥嘌呤核苷釋放蛋白(GNRP)識別胞質(zhì)溶膠中特異的Rab蛋白，誘導(dǎo)GDP的釋放并和GTP結(jié)合，進(jìn)而改變Rab蛋白的構(gòu)型，改變了構(gòu)型的Rab蛋白暴露出其脂基團(tuán)，從而將Rab蛋白錨定到膜上。運(yùn)輸小泡形成后，在V-SNARE的引導(dǎo)下，到達(dá)受體膜的T-SNARE部位，Rab幫助小泡與受體膜結(jié)合。Rab蛋白上的GTP水解后從膜中釋放出來，而小泡卻鎖定在受體膜上，釋放出的Rab進(jìn)入胞質(zhì)溶膠進(jìn)行再利用(圖9-72)。 圖9-72 Rab蛋白在小泡運(yùn)

36、輸和融合中的調(diào)節(jié)作用ÄRab蛋白作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 有一些離體實(shí)驗(yàn)支持Rab蛋白在小泡運(yùn)輸和融合中的作用。如Rab5定位于初級內(nèi)體的膜上, 無細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)表明, 初級內(nèi)體間的相互融合需要Rab5的存在, 也不能用其它類Rab蛋白取代。加入Rab和GTP后初級內(nèi)體間就能發(fā)生融合, 說明Rab和GTP是初級內(nèi)體融合的觸發(fā)劑。同樣發(fā)現(xiàn)Rab1蛋白是ER同高爾基體小泡所必需的。什么是Rab蛋白? 在小泡轉(zhuǎn)運(yùn)中有什么作用?對于Rab的功能有否實(shí)驗(yàn)證明?Æ小泡融合模型根據(jù)SNARE假說以及對Rab蛋白等生化和遺傳學(xué)研究結(jié)果表明, 小泡融合時,需要V-SNARE、T-SNARE和融合蛋白SN

37、AP25的存在。將含有純化的V-SNARE的人工脂質(zhì)體與含有T-SNARE/SNAP25復(fù)合物的脂質(zhì)體一起溫育,漸漸地兩種膜融合到一起, V-SNARE、T-SNARE/SNAP25出現(xiàn)在同一種膜上。在細(xì)胞中融合只要幾秒鐘,但需要幾種胞質(zhì)溶膠蛋白的參與,包括NSF、-、-和-SNAPs,它們的作用可能是使V-SNARE、T-SNARE/SNAP25解離以便于再利用, 同時擴(kuò)大融合。圖9-73是根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提出的小泡融合模型。 圖9-73 運(yùn)輸小泡尋靶與融合模型運(yùn)輸小泡通過小泡膜中的V-SNARE與靶膜T-SNRE/SNAP25復(fù)合物的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用,形成螺旋結(jié)構(gòu),使運(yùn)輸小泡附著到受

38、體膜。小泡膜中的Rab蛋白作為小泡尋靶和融合的定時器；通過多個V-SNARE與靶膜T-SNRE相互作用以及ATP的水解形成預(yù)融合復(fù)合物； 預(yù)融合開始之后立即進(jìn)行融合,但詳細(xì)機(jī)理不清；在融合過程中,相互作用的蛋白進(jìn)行解離,如T-SNARE/V-SNARE/SNAP25相互分開,促進(jìn)了進(jìn)一步的融合； 含有V-SNARE小泡的形成并回到原始膜中。9.6.5 膜的生物發(fā)生(membrane biogenesis)細(xì)胞質(zhì)膜以及內(nèi)膜系統(tǒng)的膜是怎樣合成的，曾提出兩個模型:Ä自裝配模型(spontaneous self-assembly)。該模型認(rèn)為膜是自我裝配的，為了驗(yàn)證這一模型，用純化的脂和蛋白在體外裝配時總是形成脂質(zhì)體，這種脂質(zhì)體與活細(xì)胞膜的一個