一種高效_快捷_經濟的小鼠胰島細胞分離純化方法

1、第15卷第1期2011年2月生命科學研究Life Science ResearchVol15No1Feb. 2011一種高效、快捷、經濟的小鼠胰島細胞分離純化方法徐小明a ，b ，林戈a ，b ，段馨a ，盧光琇a ，b*（中南大學a. 生殖與干細胞工程研究所；b. 人類干細胞國家工程研究中心，中國湖南長沙410008）摘要：采用改良的膠原酶P 膽總管內逆行灌注膨脹胰腺的分離方法，比較Ficoll -400不連續(xù)密度梯度離心法和人工挑取法兩種純化胰島的方法，用雙硫腙（DTZ ）對胰島細胞團進行特異性染色計算胰島產量及純度，用臺盼藍染色判定胰島細胞活性，使用間接免疫熒光法檢測體外培養(yǎng)7d 后胰島

2、的功能. 采用人工挑取法平均每只小鼠可獲取的胰島細胞團（245±35.6個）明顯高于密度梯度離心法（120±26.3個）（n =5，P <0.05），兩種方法分離純化的胰島活力均大于98%；但人工挑取法獲得胰島細胞團的純度（100%）要高于密度梯度離心法（90%）；純化胰島所用時間，采用人工挑取法（22±4min ）也少于密度梯度離心法（31±3min ）. 間接免疫熒光染色檢測體外培養(yǎng)7d 后的胰島細胞團，兩種方法分離純化的胰島細胞團均具有良好的功能. 膠原酶P 膽總管內灌注消化分離法聯(lián)合人工挑取純化胰島細胞團的方法，是一種高效、快捷、經濟的小鼠

3、胰島細胞團分離純化方法.關鍵詞：胰島；分離純化；小鼠中圖分類號：R322文獻標識碼：A文章編號：1007-7847（2011）01-0046-05An Efficient ，F(xiàn)ast and Economic Method for Isolation andPurification of Mouse Islet Cell Massesb b b*XU Xiao -ming a ，LIN Ge a ，DUAN Xin a ，LU Guang -xiu a ，（a. Institute of Reproductive and Stem Cell Engineering ；b. National E

4、ngineering and Research Center of Human Stem Cells ，Central South University ，Changsha 410008，Hunan ，China ）Abstract ：A modified method for mouse islet isolation was reported. Pancreas of mice was perfused with collagenase P via the bile duct. A comparison of two purification islets methods of densi

5、ty gradient centrifugation using Ficoll -400and artifical pick ，islets was then tested for their specificity ，vitality and physiological function by dithiozine （DTZ ），Typan Blue and indirect immunoflurescence staining respecti -vely. The average number of islet cell masses obtained of each mouse for

6、 artificial pick method （245±35.6）was significantly higher than that of density gradient centrifugation method （120±26.3）（n =5，P <0.05）. The vitality of both methods to isolate and purify islet was more than 98%.The average time of purification islet by artificial pick method （22±4

7、min ）was less than that of density gradient centrifugation method （31±3min ）. Islets isolated by both methods have good physiological function with indirect immunofluorescence staining after cultured 7d in vitro . The modified method which pancreas of mice was perfused with collagenase P via th

8、e bile duct and then artificial pick for islet purification is an efficient ，fast and economic isolation and purification of mouse islet.收稿日期：2010-09-18；修回日期：2010-11-03基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973”項目（2005CB522705）；國家自然科學基金資助項目（30800650）；湖南省自然科學基金資助項目（09JJ4010）作者簡介：徐小明（1976-），男，湖南邵陽人，博士，主要從事干細胞與體細胞核移植領域的研究；

9、*通訊作者：盧光琇（1939-），女，湖北天門人，中南大學教授，博士生導師，主要從事人類生殖與干細胞方面的研究，Tel E -mail ：lugxdirector.第1期徐小明等：一種高效、快捷、經濟的小鼠胰島細胞分離純化方法47Key words ：islet ；isolation and purification ；mouse（Life Science Research ，2011，15（1）：046050）糖尿病已成為威脅人類健康的第三大殺手，全球患者已經超過4000萬. 目前，胰島細胞移植是治療I 型糖尿病最有效的途徑之一，但高效、快捷的分離手段是制約胰島

10、細胞移植的一個重要因素. 實驗動物大鼠1、豬2的胰島細胞分離已基本完善，小鼠具有品系純正、可重復性好、繁殖力強、科研周期短和可進行基因調控等諸多優(yōu)點，已廣泛應用于胰島移植和糖尿病研究領域. 但小鼠由于體積小，胰腺及膽總管解剖結構細微，這對小鼠胰島細胞團分離操作造成一定的難度. 本研究以小鼠為實驗動物模型，在借鑒前人分離純化小鼠胰島細胞方法的基礎上，結合本實驗室自身條件，對其進行優(yōu)化改良，比較Ficoll -400不連續(xù)密度梯度密度離心法和人工挑取法兩種小鼠胰島細胞團分離純化方法，旨在提高小鼠胰島產量、純度、活力及功能.稱取Ficoll -40062.5g ，加入200mL 分離液，37水浴加熱

11、，震蕩，使其充分溶解，最后定容250mL ，即配成25%Ficoll -400溶液；充分混勻后量取25%Ficoll -400溶液160mL ，加入分離液13.9mL ，配成23%Ficoll -400溶液；取23%Ficoll -400溶液100mL ，加入分離液15mL ，配成20%Ficoll -400溶液；取20%Ficoll -40040mL ，加入分離液32.7mL ，配成11%Ficoll -400溶液. 0.22m 孔徑濾膜過濾，調pH 值至7.27.4，4保存.1.2.3小鼠胰島的分離按60mg /kg 劑量對小鼠行腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉. 75%乙醇消毒皮膚，無菌剖腹，

12、暴露胰腺及膽總管，縫線結扎膽總管入十二指腸處. 從膽總管進針（28G ），逆行緩慢注入4預冷的膠原酶P （0.8g /L ）2mL ，使胰腺充分膨脹. 剪心放血處死小鼠，剪除胃與橫結腸之間的大網膜及脾臟，沿十二指腸邊緣自十二指腸向小腸方向剝離胰腺組織. 剩余部分沿胰腺邊緣完整取出，完整胰腺入含有3mL 4預冷膠原酶P 的50mL 離心試管中. 37水浴消化1317min ，振蕩使其呈細砂狀，加入4含10新生牛血清（NBS ）的Hanks 液10mL ，終止消化，孔徑600m 不銹鋼濾網篩過濾，1500r /min 離心2min ，棄去上清，4含10%NBS 的Hanks 液重新清洗離心1遍，收

13、集沉淀. 1.2.4胰島細胞團的純化密度梯度離心法：用5mL 25%的Ficoll -400溶液充分重懸分離的組織沉淀，小心輕柔依次加入23%，20%和11%的Ficoll -400溶液各2mL ，1800r/min4水平離心15min ，收集20%11%界面上的細胞層（大多數(shù)胰島細胞團在這層），也收集23%20%界面細胞層（小部分胰島細胞團）. 胰島細胞團用含10%NBS Hanks 液洗滌2次，1500r /min 離心2min. 定時器記錄從用25%的Ficoll -400溶液重懸組織沉淀到獲得純化的胰島細胞團之間的時間.人工挑取法：組織沉淀用4預冷的含10%NBS Hanks 液重懸后

14、入直徑10cm 培養(yǎng)皿中，由于胰島形態(tài)及折光性同消化脫落的胰腺組織有明顯的差別，因此，使用自制口吸管連接內徑為11.1材料與方法試驗材料812周齡的雄性ICR 小鼠，購自中南大學實驗動物學部，清潔環(huán)境喂養(yǎng)；膠原酶-P 為Roche 公司產品；Ficoll -400為Pharmacia 公司產品；RPMI 1640培養(yǎng)基、HBSS 緩沖液和胎牛血清（FBS ）由Gibco 公司提供；新生牛血清（NBS ）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰島素（Insulin ）抗體購自美國SANTA CRUZ 生物科技公司；胰高血糖素（Glucagon ）抗體購自Cell Signaling 公司；胰多肽（

15、Pancreatic Polypeptide ，pp ）抗體及山羊抗兔Alexa Flour 594二抗均購自Millipore 公司；4%多聚甲醛購自上海西唐生物科技有限公司；其余試劑均購自Sigma 公司. 1.2試驗方法1.2.1分離液和消化液的配制分離液（dissociation buffer ）的配制：Hanks 液500mL 加入10mmol /L 羥乙基哌嗪乙磺酸（hy -droxyethyl piperazine ethanesulfonic acid ，HEPES ），0.22m 孔徑濾膜過濾，調節(jié)pH 值至7.27.4，4保存.消化液的配制：臨用之前新鮮配制，用分離液溶解膠

16、原酶P ，濃度為0.8g /L.1.2.2Ficoll -400濃度梯度溶液的配制48生命科學研究2011年500m （吸取大胰島細胞團）或200m （吸取小胰島細胞團）玻璃毛細管，體視顯微鏡下人工機械挑取胰島細胞團. 胰島細胞團用含10%NBS Hanks 液洗滌2次. 定時器記錄從用含10%NBS Hanks 溶液重懸組織沉淀到獲得純化的胰島細胞團之間的時間.1.2.5胰島細胞團活性鑒定和特異性染色以臺盼藍染色判定胰島細胞活性，死亡細胞被染成藍色，而活細胞不著色. 稱取雙硫腙（Dithizone ，DTZ ）粉末10mg 溶于1mL DMSO 中，取20L 加入到2mL HBSS （pH

17、7.4）緩沖液中，0.22m 濾膜過濾除菌. 加入0.1g/L的雙硫腙對胰島細胞進行特異性染色，室溫孵育10min ，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并計算胰島產量及純度（純度=DTZ 染色陽性的細胞團數(shù)目/細胞團總數(shù)×100%）.1.2.6胰島細胞體外培養(yǎng)分離純化的胰島細胞團轉入6孔細胞培養(yǎng)板中，加入10%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于375%CO 2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 每孔接種50個左右胰島細胞團，每隔兩天換液一次，體外原代培養(yǎng)7d 后進行細胞傳代. 1.2.7間接免疫熒光染色方法FITC （山羊抗小鼠），室溫避光孵育45min ，PBS 清洗3遍，每次5min ，DA

18、PI 復染核，PBS 清洗3遍，每次5min ，普通熒光顯微鏡下觀察并照相. 1.2.8統(tǒng)計學分析應用spss13.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用方差分析，P <0.05表明有統(tǒng)計學差異.221結果胰島細胞團鑒定及活性檢測新分離的胰島細胞團大小不一，直徑從50m 到600m 不等，呈圓形或卵圓形，胰島細胞胞漿豐富，大多數(shù)胰島細胞團胞膜完整，折光性好（圖1A ，B ）. 使用密度梯度離心法分離純化的胰島細胞團中混雜著少量腺泡組織. DTZ 染色后，90%的細胞團染成猩紅色，腺泡細胞未著色，純度為90%.使用人工挑取法分離純化的胰島細胞團，很少見腺泡細胞混雜，DTZ 染色，100%的細胞團

19、染成猩紅色（圖1C ，D ），純度達100%.兩種方法分離的胰島細胞團臺盼蘭染色，絕大多數(shù)細胞未著色，活胰島細胞均超過98%.2.2兩種方法分離純化胰島細胞團效率比較使用密度梯度離心法，平均每個小鼠可以得到120±26.3個胰島細胞團，而使用人工挑取法，則可以得到245±35.6個胰島細胞團，產量提高1倍. 純化胰島所用時間，采用人工挑取法（22±4min ）也少于密度梯度離心法（31±3min ），另外，使用人工挑取法不需要購買Ficoll -400，節(jié)約了成本，不但省去了繁瑣的配置各個濃度梯度的步驟，而且去除了Ficoll -400對胰島細胞存在的可

20、能毒性（表1） .原代培養(yǎng)7d 的胰島細胞用4%的多聚甲醛室溫固定15min ，0.1%Triton -X -100透膜10min ，PBS 清洗3遍，每次5min ，山羊血清室溫封閉45min ，一抗Insulin ，兔多抗，使用濃度150；Glucagon 抗體，鼠單抗，使用濃度1200；Pan -creatic Polypeptide （pp ）抗體，兔多抗，使用濃度1200，4孵育過夜，PBS 清洗3遍，每次5min ，加入相應的二抗Alexa Flour 594（山羊抗兔）或圖1小鼠胰島細胞團分離及雙硫腙染色（A ，B ）新鮮分離的小鼠胰島細胞團（A ），×100；（B ）

21、，×200；（C ，D ）新鮮分離的小鼠胰島細胞團雙硫腙（DTZ ）染色呈猩紅色. （C ），×100；（D ），×200.Fig.1Isolation of mouse islet cell masses and diphenylthiocarbazone （DTZ ）staining （A ，B ）Fresh isolated islet cell masses （A ），×100；（B ），×200；（C ，D ）DTZ staining of fresh islet cell masses. （C ），×100；（D ），&#

22、215;200.第1期徐小明等：一種高效、快捷、經濟的小鼠胰島細胞分離純化方法表1兩種方法分離純化胰島細胞團的比較49Table 1Comparison of two methods with isolation and purification mouse islet cell masses MethodDensity gradient centrifugation Artifical pickYields each mouse120±26.3a 245±35.6bPurity 90%100%Vitality >98%>98%Time for purifica

23、tion/min31±3a 22±4bToxicity of Ficoll -400to isletYes NoCost High Low注：同列字母不同表示差異顯著（P <0.05）.） . Notes ：Different superscripts in the same line indicate a significant difference （P <0.052.3胰島細胞培養(yǎng)培養(yǎng)后12h ，胰島細胞團均未貼壁，24h后，部分胰島細胞團貼壁生長（圖2A ），胰島細胞團折光性強，周圍有少量細胞游出，呈三角型，多邊形、梭形和圓形. 48h 后大部分胰島細胞

24、團貼壁生長，周圍細胞逐漸增多，細胞生長旺盛，鋪成單層，折光性好（圖2B ，C ）. 體外培養(yǎng)7d 后，胰島細胞團之間彼此通過游出的細胞連成一片，有的胰島細胞團邊緣變得模糊不清，胰島細胞團周圍有復層細胞生長，大部分細胞呈鋪路石狀上皮樣細胞生長，在單層的上皮樣細胞上面可見圓形的細胞或成簇或成條或單在生長（圖2D ，E ）. 傳代后，胰島細胞呈漩渦式生長（圖2G ），大部分細胞呈鋪路石狀（圖2H ），也可見部分圓形細胞散在分布（圖2F ），折光性強. 傳3代后，細胞增殖明顯緩慢，折光性稍差（圖2I ）. 2.4間接免疫熒光染色對體外培養(yǎng)7d 的胰島細胞團進行胰島特異細胞染色，發(fā)現(xiàn)分泌glucagon

25、 的細胞，散在分布在胰島細胞團邊緣區(qū)域（圖3A C ），產生Insulin 的細胞則主要分布在胰島細胞團內部區(qū)域（圖3D F ），分泌Pancreatic Polypeptide 的pp 細胞，則少量存在胰島邊緣區(qū)域（圖3G I ）. 我們的染色結果顯示，體外培養(yǎng)7d 的胰島細胞團仍然維持良好的功能.圖2小鼠胰島細胞體外培養(yǎng)（A ）小鼠胰島細胞團培養(yǎng)后24h ，貼壁生長，邊緣少量細胞游出；（B ，C ）小鼠胰島細胞團培養(yǎng)后48h ，大量細胞游出；（D ，E ）體外培養(yǎng)7d 后，細胞生長旺盛，在單層鋪路石樣細胞上面有圓形細胞生長；（F ）游出的圓形細胞，折光性好；（G H ）傳代后胰島細胞呈漩渦

26、狀，鋪路石樣生長，少量圓形細胞分布周圍；（H ）第三代胰島細胞. （A I ）×100.圖3體外培養(yǎng)7d 后胰島細胞團特異性染色（A ，D ，G ）明場；（B ，E ，H ）DAPI 染色；（C ）Insulin 抗體染色，陽性細胞主要分布在胰島細胞團內部區(qū)域；（F ）Glucagon 抗體染色，陽性細胞散在分布在胰島邊緣位置；（I ）Pancreatic Polypeptide （pp ）抗體染色，只有少量陽性細胞存在邊緣區(qū)域. （A -I ）×100.Fig.2Mouse islet cells cultured in vitro （A ）Islet cell mass

27、 after cultured for 24h in vitro ；（B ，C ）Islet cell mass after cultured for 48h in vitro ，a lot of cells migration from islet cell masses ；（D ，E ）Islet cell mass after cultured for 7d in vitro ；（F ）Round islet cells with good refractivity ；（G H ）Islet cells were swirling and cobblestone -like growth

28、 after passage ；（H ）Islet cells with passages 3；（A I ）×100.Fig.3Specific antibody staining of islet cell masses byindirect immunofluorescence after cultured 7d in vitro （A ，D ，G ）Bright field ；（B ，E ，H ）DAPI staining ；（C ）Insulin antibody staining ；（F ）Glucagon antibody staining ；（I ）Pancreatic

29、 polypeptide antibody staining. （A -I ）×100.50生命科學研究2011年3討論胰島移植是一種治療胰島素依賴型糖尿病需要在體視顯微鏡下練習吸取細胞團的操作，其熟練程度決定胰島分離的效率和質量，以筆者從事胚胎工程研究10余年的經驗而言，覺得初學者花一定的時間來練習這一操作是十分必要和值得的.檢測分離純化后體外培養(yǎng)的胰島細胞是否具有良好的功能，使用特異性抗體進行間接免疫熒光染色是非常直接有效的方法. 通過間接免疫熒光方法，我們發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)7d 的胰島細胞團仍分泌胰島素（insulin ）、胰高血糖素（glucagon ）及胰多肽（pancreati

30、c polypeptide ）. 并且陽性細胞的分布基本符合細胞，細胞及pp 細胞分布規(guī)律. 我們的染色結果提示，體外培養(yǎng)7d 的胰島細胞團仍然維持其良好的生理功能.參考文獻（References ）：1KIM J Y ，LEE J I ，JEONG J H ，et al. Improved yield and functional parameters of rat pancreas islets isolated under intramuscular anesthesiaJ.Cell Transplantation ，2010，19（6）：743-750.ANAZAWA T ，BALAM

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32、 pancreas J .Diabetes ，1967，16（1）：35-39.JINDAL R M ，GRAY D W ，CHPO S I. Techniques of pancreatic islet isolation and purificationJ.The Mount Sinai Journal of Medicine ，1994，61（1）：45-50.GOTOH M ，MAKI T ，KIYOIZUMI T ，et al. An improved method for isolation of mouse pancreatic isletsJ.Transplan -tation

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34、on of），2006，29（5）：mouse isletJ.Chinese Journal of Anatomy660-661.王威巍，王濟明，杜成友. 不同純度攜帶干細胞胰島轉分化培養(yǎng)前后PDX -1的表達研究J.生命科學研究（WANG Wei -wei ，WANG Ji -ming ，DU Cheng -you. The expression of PDX -1mRNA in different pancreatic islets purity that contain stem cells before and after transdifferentiated cultureJ.Life Science Research ），2009，13（1）：50-54.宋科瑛