一株青霉菌的分離鑒定及抑菌活性成分研究中文

1、西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2009,18(4):982102一株青霉菌的分離鑒定及抑菌活性成分研究楊利珍1,周樂(lè)2,徐虹1,秦寶福13(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西楊凌712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西楊凌)摘要:,經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、ITS序列分析及與馬爾尼菲青霉菌的比較分析表明,L2verrucu2losumYL252),其Genbank注冊(cè)序列號(hào)為EU914140。,對(duì)細(xì)菌和植物病原真菌都有一定的抑制作用,80%以上。乙酸乙酯相TLC,、萜類、甾體及其苷類、酚性成分、內(nèi)酯及香豆素和有機(jī)酸類。關(guān)鍵詞:狼毒根際;YL(PenicilliumverruculosumYL252);抑菌活性;成

2、分預(yù)試:A文章編號(hào):100421389(2009)0420098205andIdentificationandAntifungalActivityofaPenicilliumYANGLizhen1,ZHOULe2,XUHong1andQINBaofu13(1.CollegeofLifeScience,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100,China;2.CollegeofScience,NorthwestA&FUniversity,YanglingShaanxi712100,China)Abstract:Bystreakpla

3、temethod,astrainofhighantifungalactivemicroorganismwasisolatedfromtheparticularecologicalenvironment2therhizosphereofStellerachamaejasme.Morphologicalcharac2teristics,sequencesanalysisofITSandcomparationanalysiswithPenicilliummarneffeirevealedthatitbelongedtothePenicilliumverruculosumYL252,itsGenBan

4、kaccessionnumberisEU914140.Re2sistantexperimentshowedthattheextractoffermentativeliquidcouldresistmanymicroorganisms.ItsinhibitionratestoFusariumbulbigenum,Valsamali,Alternariosolanireachedabove80%.TheTLCsystemicpretesofethylacetateextractshowedthatthemainingredientsarevolatileoils,fla2vonoids,terpi

5、ns,steroidsaponinsanditsglycosides,phenils,cumarinsandlactones,organicacids.Keywords:TherhizosphereofStellerachamaejasme;Isolationandidentification;Penicilliumverru2culosumYL252;Antimicrobialactive;Systemicpretes微生物是產(chǎn)生天然活性化合物的天然寶庫(kù)。據(jù)估計(jì),現(xiàn)在已知的細(xì)菌不到總數(shù)的1%,已知的真菌不到總數(shù)的5%,表明還有成千上萬(wàn)的微生物種類有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)1。而且不同的生態(tài)環(huán)境下微生物的

6、種類和數(shù)量不同,進(jìn)而也會(huì)產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝物2。青霉菌作為一種潛在的活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌之一,已報(bào)道的活性化合物就有青霉素類抗生素,生物堿類324、蒽醌類5、芳香類6、3收稿日期:2008210220修回日期:2009202228醇類及酯酸類等次級(jí)代謝物5,還有Vermistatin類728、Funicone2likeCompound9210,菌素類像布雷菲得菌素11等等,但更多的是對(duì)其產(chǎn)生的酶類像纖維素酶和木質(zhì)素酶類的研究報(bào)道12215。本試驗(yàn)采用的青霉菌是來(lái)自秦嶺約2000m海拔的瑞香狼毒根際土中,由于瑞香狼毒全株有毒,其根有劇毒,研究這一特殊生態(tài)環(huán)境下的微生物對(duì)豐富微生物資源和發(fā)現(xiàn)新的抑菌先

7、導(dǎo)化合物均具有基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(30771454);西北農(nóng)林科技大學(xué)科研專項(xiàng)基金(8080268)。作者簡(jiǎn)介:楊利珍(1983-),女,碩士研究生,研究方向:植物資源化學(xué)。E2mail:nicenice20053通訊作者:秦寶福。E2mail:baofu_qin© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 4期楊利珍等:一株青霉菌的分離鑒定及抑菌活性成分研究99重要的意義。1材料與方法1.1材料1.1.1試驗(yàn)菌種從秦嶺瑞香狼毒(Stelleracham

8、aejasmeL.)根際土中篩選出的一株生長(zhǎng)旺類資料19220,對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。1.2.3菌的分子生物學(xué)鑒定(ITS法)先提取DNA17,將提取的rDNAITS基因PCR擴(kuò)增:采用真菌通用引物ITS1、ITS4擴(kuò)增rDNAITS,上、下游引物序列分別為:ITS1:52TCCGTAGGT2GAACCTGCGG23;ITS4:52TCCTCCGCT2TATTGATATGC23。PCR反系(25L)ITS11L,410.L,10×2.5,ddH2,1.5L。:3min;95變性30,56s;72延伸40s,33個(gè)循環(huán);3min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè):取5L盛的真菌。1.1.2活性檢測(cè)靶菌枯

9、草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),大腸桿菌(E.Coli),南瓜枯萎病原菌(Fusariumbulbinum),蘋果干腐病原菌(Bakerirehm),病原菌(Macrophomakaw(Valsamali),(ulate),capsici),小麥赤霉病原菌(graminearun),玉米彎孢(Curvularialunata),番茄灰霉(Botrytiscire2rea),番茄早疫病原菌(Alternariosolani)及馬鈴薯干腐病菌(Fusariumoxysporiu

10、m)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.3主要試劑和儀器DNA剪切酶,連接酶,PCRTaqase等均購(gòu)自Takara公司,DNA回收試劑盒購(gòu)自U2gene生物公司。美國(guó)Bio2Rad公司的PTC200型PCR儀和德國(guó)Eppendorf公司的5415D型高速離心機(jī)。薄層層析硅膠GF254,石油醚,乙酸乙酯,正丁醇(分析純),購(gòu)自西安化學(xué)試產(chǎn)物加1L6×上樣緩沖液,于含EB的1%瓊脂糖凝膠上100V電泳40min,在紫外燈下觀察結(jié)果。之后對(duì)PCR產(chǎn)物回收、連接、重組,所得的rDNAITS序列經(jīng)Invitrogen公司測(cè)序,在Gen2Bank(gb2adminncbi.n

11、)中注冊(cè)搜索序列號(hào),并在核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http:/www.ncbi.nlm.nih/blast)中進(jìn)行同源序列搜索與比對(duì)。1.2.4菌的平板鑒定將已活化好的菌株分別接種在沙保羅和查氏培養(yǎng)基上,與25和37下分別培養(yǎng)67d,觀察菌落形態(tài)。1.2.5菌的發(fā)酵液抗菌活性測(cè)定做不同溶劑劑廠。1.1.4培養(yǎng)基固體馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA),查氏培養(yǎng)基(Czapeksmedium),固體肉汁胨培養(yǎng)基(BPA),酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(LB),參考文獻(xiàn)16配制。鑒別培養(yǎng)基:沙保羅培養(yǎng)基(SDA),購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司。1.2方法1.2.1瑞香狼毒根際土中菌的篩選及分離純化萃取

12、物的抑菌活性時(shí),將活化好的該菌種打出菌餅,接入液體PDA培養(yǎng)基中(每個(gè)500mL三角瓶裝200mL培養(yǎng)基,打菌餅23個(gè)),28,150r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)89d。發(fā)酵液用布氏漏斗抽濾,得到的濾液用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次,每次30min,靜置分層,得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相,均濃縮為10mL。采用枯草芽孢桿菌為指示菌,測(cè)其抑菌圈,對(duì)照組為萃取的不同溶劑21。對(duì)活性強(qiáng)的部分進(jìn)行抗細(xì)菌和真菌試驗(yàn)。其中對(duì)細(xì)菌的抑菌活性檢測(cè)方法采用濾紙片法22,濾紙片直徑為0.6cm,對(duì)照組為相應(yīng)溶劑。對(duì)真菌抑菌活性檢測(cè)法采用生長(zhǎng)速率法23,打孔器直徑為0.7cm,對(duì)照組為蒸餾水,測(cè)量

13、菌落直徑(采用十字交叉法),計(jì)算相對(duì)抑菌率。相對(duì)抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-打孔器直徑)-(處理菌落直徑-打孔器直徑)/(對(duì)照菌落直徑-打孔器直徑)×100%。1.2.6乙酸乙酯相的薄層層析系統(tǒng)預(yù)試將乙將秦嶺瑞香狼毒根際土用稀釋涂布法分離并培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基上,在28培養(yǎng)6d后觀察菌落形態(tài)特征17218。將已于PDA平板中活化的活性好的菌種挑選菌落,用平板劃線法進(jìn)行純化。將純化好的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上,在28下培養(yǎng)6d后觀察菌落形態(tài)特征。1.2.2菌的鑒定2插片法將已消毒好的蓋玻片以45度角插入培養(yǎng)基中,再用接種環(huán)將菌接種于蓋玻片與培養(yǎng)基相接的沿線處,置28下培養(yǎng);每3d取一次片,制

14、片,鏡檢。對(duì)照相關(guān)的真菌分© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 100西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)18卷酸乙酯相的樣品點(diǎn)于薄層層析薄板上,在不同極性的展開(kāi)劑中展開(kāi),對(duì)各種不同的預(yù)試成分噴以不同的顯示劑,觀察顯色現(xiàn)象24。2結(jié)果與分析2.1瑞香狼毒根際土中菌的篩選及分離純化結(jié)果通過(guò)瑞香狼毒根際土的平板稀釋涂布法,發(fā)現(xiàn)有200多個(gè)微生物種類,并從其中發(fā)現(xiàn)了一具有高抑菌活性的真菌,在它的周圍其他菌很難生長(zhǎng),從而形成其特定的“勢(shì)力范圍”。對(duì)該菌進(jìn)行平板劃線分離純化,得到一青色菌

15、落(圖1)菌落特征為:培養(yǎng)3d后,后直徑達(dá)2cm;生長(zhǎng),背面為血紅色。,不透明,干燥,有特味。與培養(yǎng)基結(jié)合牢固。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),淡黃色消失,最終為墨綠色。(400倍)morphologyofverruculosum(x400)圖3青霉菌DNA的PCR電泳圖Fig.3TheelectrophoresisofpenicilliumDNA電泳檢測(cè)表明,該DNA片段大約為500bp,經(jīng)BLAST檢索系統(tǒng)檢測(cè)其ITS序列為:TTTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCGTGGTAAAATATGGTGGTGACCAACCCC

16、圖1疣孢青霉菌在PDA上的菌落形態(tài)圖Fig.1ColonyshapeofPenicilliumverruculosumonPDACGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCCGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCGGGGGGACCGCACCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCT

17、GCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCATAGTACTCAGACAGTCCATCTTCATCAGGGTTCACAGGGCGCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGAGCGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCAAAGCAACAGGTGTAGAGAGACAAGGGTGGGAGGT2TGG2.2顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯微鏡檢特征圖2顯示,菌絲無(wú)色,有隔膜;分生孢子梗單枝,較長(zhǎng),無(wú)足細(xì)胞,有橫隔膜;孢子梗頂端不膨大,排列成帚狀的間枝,分枝1次或2次,對(duì)稱,頂層為小梗,上生分生孢子串,分生

18、孢子串呈不分枝的鏈狀;帚狀枝較短,排列緊密。單個(gè)分生孢子為球形或橢圓形,紫紅色。有性孢子不詳或不發(fā)生。對(duì)該真菌的菌落特征和顯微特征初步鑒定為半知菌綱,叢梗孢目,叢梗孢科,青霉族,青霉屬。2.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果提取DNA后,在PCR儀上擴(kuò)增,其凝膠電泳見(jiàn)圖3。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 4期楊利珍等:一株青霉菌的分離鑒定及抑菌活性成分研究101其ITS序列為530bp的長(zhǎng)度,與馬爾尼菲青霉菌和疣孢青霉菌高度同源(同源率為98%)。但馬爾尼菲青霉

19、菌為雙相菌,其在25培養(yǎng)34d為白色絨毛樣菌落,菌落周圍出現(xiàn)水溶性的葡萄酒樣紅色色素,鏡下可見(jiàn)特征性的帚狀枝;37孵育時(shí)為白色酵母樣菌落,無(wú)色素,鏡下可見(jiàn)圓形、卵圓形及特征性臘腸樣孢子。通過(guò)對(duì)其在37培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該青霉菌在此溫度下不生長(zhǎng),從而鑒定該菌為疣孢青霉菌24,GenBank序列號(hào)為EU914140。2.4平板鑒定培養(yǎng)結(jié)果25下可以正常生長(zhǎng),但在37文獻(xiàn)25,。2.5發(fā)現(xiàn)其萃取物抑菌活性由強(qiáng)到弱的順序?yàn)橐宜嵋阴ハ?平均抑菌圈直徑為16cm)>石油醚相(平均抑菌圈直徑為8.5cm)>正丁醇相(平均抑菌圈直徑為8cm)。表明該菌的乙酸乙酯相具有相對(duì)高的活性。采用濾紙片法檢測(cè)疣孢青霉菌

20、YL252發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用,1。表1TableThebacterium抑菌作用InhibitioneffectBussubtilis+Bacilluscereus+金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus+大腸桿菌E.Coli+注:+.抑菌圈直徑>20mm;+.15mm抑菌圈直徑20mm;+.抑菌圈直徑<15mm。Note:"+"Diameterofthezonebyantibioticactivity>20mm;"+"15mmDiameterofthezonebyantibioticactivity2

21、0mm;"+"Diameterofthezonebyantibioticactivity<15mm.252發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾后用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取,以枯草芽孢桿菌為指示菌,用濾紙片法測(cè)其抑菌活性,表2乙酸乙酯萃取物的抗真菌活性Table2Theantifungiactivityoftheethylacetateextract病原真菌Pathogenicfungi番茄早疫蘋果干腐南瓜枯萎小麥赤霉辣椒疫霉AlternariosolaniBakerirehmFusariumbulbigenumFusariumgraminearunPhytophthoraca

22、psici抑菌率/%Inhibitionrates80.2780.8739.4166.2029.02病原真菌Pathogenicfungi蘋果炭疽Clanerelacinyulate番茄灰霉Botrytiscirerea玉米彎孢Curvularialunata馬鈴薯干腐Fusariumoxysporium蘋果腐爛Valsamali抑菌率/%Inhibitionrates57.1057.6474.4756.7683.33注:表中抑菌率為3次菌落直徑的平均值計(jì)算所得。Note:Theinhibitionratesaretheresultofaverageofthethree2timesdiamet

23、erofthezonebyantifungalactivity.表3乙酸乙酯相的薄層層析系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果Table3TheresultoftheTLCsystemicpretesofethylacetateextract序號(hào)Serialnumber123456789預(yù)試成分Pretecontents顯色劑Sprayreagent5%香草醛2濃硫酸1%ALCl3溶液現(xiàn)象Phenomenon預(yù)試結(jié)果Preteresult揮發(fā)油紫色斑點(diǎn)+黃酮類黃,藍(lán)斑點(diǎn)熒光加強(qiáng)+生物堿改良碘化鉍鉀顯色無(wú)_萜類甾體及其苷元5%磷鉬酸乙醇溶液,120烘烤5min變?yōu)樯钏{(lán)色斑點(diǎn)+蒽醌及其苷5%KOH,90烘烤橙黃色斑點(diǎn)+1%

24、FeCl3與1%K3Fe(CN)6酚性成分藍(lán)色斑點(diǎn)+強(qiáng)心苷先噴2%3,52二硝基苯甲酸乙醇溶液,再噴4%NaOH乙醇溶液無(wú)_內(nèi)酯及香豆素氨熏氨熏藍(lán)色,黃色熒光加強(qiáng),有的藍(lán)色點(diǎn)先無(wú)后出現(xiàn)+氨基酸0.2%茚三酮乙醇溶液無(wú)-注:"+"表示反應(yīng)現(xiàn)象非常明顯;"+"表示反應(yīng)現(xiàn)象較為明顯;"+"表示反應(yīng)現(xiàn)象不明顯,但還能看得出來(lái);"-"表示反應(yīng)為陰性。Note:"+"expressesmorepositiveresult;"+"representspositiveresult;"

25、;+"meanslesspositive;"-"meansnegativeresult.從表1可以看出,疣孢青霉菌YL252發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最明顯,對(duì)枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌次之,對(duì)大腸桿菌的作用最弱。從表2可以看出,疣孢青霉菌YL252對(duì)真菌番茄早疫病原菌,蘋果干腐病原菌和蘋果腐爛病原菌的抑菌率均達(dá)到80%以上。說(shuō)明其對(duì)真菌具有抑菌廣譜性。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 102西北農(nóng)業(yè)

26、學(xué)報(bào)18卷mistatin,anewmetabolitefromPenicilliumvermiculatumJ.JournalofAntibiotics,1986,39(11):160521608.8N.Husain,S.A.Sarfaraz,T.B.Sultana,N.Faizi,S.Mur2taza.Isolationandidentificationofvermistatin,ergosterol,stearicacidandmannitol,metabolicproductsofPenicilliumverruculosumJ.PlantaMedica,1997,63(2):191.

27、9KimuraY,YoshinariT,ShimadaA,etal.Isofunicone,apollengrowthinhibitorproducedbyPenicilliumspJ.Phytochemistry,40(3)10馬希斌,.代謝產(chǎn)物對(duì)不2.6乙酸乙酯相的薄層層析系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果對(duì)活性較大的乙酸乙酯相薄層層析法系統(tǒng)預(yù)試結(jié)果見(jiàn)表3。從表3的系統(tǒng)預(yù)示結(jié)果可知,疣孢青霉菌YL252的主要活性成分為揮發(fā)油、黃酮類、萜類、甾體及其苷類、蒽醌類、酚性成分、內(nèi)酯及香豆素、有機(jī)酸類,不含有生物堿、強(qiáng)心苷及氨基酸類。3討論本研究對(duì)該疣孢青霉菌進(jìn)行了分子生物學(xué)2ITS序列分析,98%。說(shuō)明還有2%的不同

28、源,步的生理生化檢測(cè),的一個(gè)變種。序列及形態(tài)學(xué),為這兩種青霉菌今后的鑒定應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究對(duì)疣孢青霉菌的抑菌活性做了報(bào)道,證明其具有抑菌廣譜性,對(duì)抑菌先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)具有很大的現(xiàn)實(shí)意義,同時(shí)通過(guò)系統(tǒng)預(yù)試發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中具有黃酮類成分,這是關(guān)于青霉菌尤其是疣孢青霉菌很少報(bào)道的一類化合物。對(duì)該菌抑菌活性成分的分離純化工作正在研究之中。參考文獻(xiàn):1LeslieAA,Gunatilaka.NaturalProductsfromPlant2As2sociatedMicroorganisms:Distribution,Structural,Diversi2ty,Bioactivity,andImp

29、licationsofTheirOccurrenceJ.Nat.Prod,2006,69:5092526.2吳劍波,張致平.微生物制藥M.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:11212.3辛志宏,方玉春,朱天驕,等.海綿來(lái)源真菌黃灰青霉Sp219(46):5632565.L,T,L,etal.Analysisofbreflateinchromatographywithmassselectivede2.JournalofPharmaceuticalandBiomedicalA2nalysis,1998,16:130121309.12SolovevaIV,OkunevON,VelkovVV,etal.

30、These2lectionandpropertiesofPenicilliumverruculosummu2tantswithenhancedproductionofcellulasesandxylanasesJ.Microbiology,2005,74(2):1412146.13SkomarovskyAA,GusakovAV,OkunevON,etal.StudiesofhydrolyticactivityofenzymepreparationsofPenicilliumandTrychodermafungiJ.AppliedBiochem2istryandMicrobiology,2005

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