堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定

1、僅供個人參考For personal use only in study and research; not for commercial use堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定【實驗目的】通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)米氏常數(shù)的測定，了解其測定方法和意義。學會運用標準曲線測定酶的活性及觀察抑制劑對酶促反應動力學的影響，加深對酶促反應動力學的理解?！緦嶒炘怼勘緦嶒炓粤姿岜蕉c為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。 酚在堿性條件下與 4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深 淺和酚的含量成正比。 根據(jù)吸光值的大小可以計算出酶的活

2、性，也可以從標準曲線上查知酚的含量，進而算出酶活性的大小?！緦嶒灢襟E】1.底物濃度對酶促反應速度的影響試劑/ml管號1234560.01 mol/L 底物液0.100.200.300.400.800.0pH10.0, 0.1 mol/L 碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.70蒸餾水1.101.000.900.800.401.2037 C水浴中保溫5分鐘AKP酶液0.100.100.100.100.100.10最終底物濃度(mmol/L)0.51.01.52.04.00.0(1)取6支試管，作好標記。按下表操作：(未加抑制劑組)支試管， 做好標 記。按下 表操作：(高精 氨

3、酸組)另取6試劑/ml管號1234560.01mol/L底物液0.100.200.300.400.800.05mmol/L高精氨酸溶液0.100.100.100.100.100.10pH10.0,0.1 mol/碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.70蒸餾水1.050.950.850.750.351.1537 C水浴中保溫5分鐘AKP酶液0.100.100.100.100.100.10最終底物濃度(mmol/L)0.51.01.52.04.00.0 加入酶液(0.05卩g/ml)后，各管混勻并立即記錄時間，將上述各管置 37 C水浴中準確保溫15分鐘。(3)保溫結(jié)束，立即加

4、堿性溶液1.1 ml終止反應。 各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml , 0.5%鐵氰化鉀2.0 ml，充分混勻，放置 10分鐘，以6號空白管作對照，于510 nm波長處比色，根據(jù)酚標準曲線計算酶活性。(5)以各管基質(zhì)濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標，以各管吸光度值的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)為1/V做橫坐標，作圖求出Km值。2.酚標準曲線的繪制(1)取潔凈干燥試管6支，按下表依次加入試劑： 混勻后室溫放置15分鐘，于510 nm波長處比色。 以酚含量(卩g)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制酚標準曲線。試劑/mlAvV 口呂號僅供個人參考1234560.1 mg/ml酚標準溶液0.00.

5、050.100.200.300.40蒸餾水2.01.951.901.801.701.6037 C水浴保溫5分鐘堿性溶液1.101.101.101.101.101.100.3%4-氨基安替比林1.01.01.01.01.01.00.5%鐵氰化鉀2.02.02.02.02.02.0【實驗結(jié)果與分析】1.未加抑制劑組底物濃度S (mmol/L)0.500 1.000 1.500 2.000 4.000濃度倒數(shù)1/S2.000 1.000 0.667 0.500 0.250吸光度V0.129 0).246 0.288 0.387 0.752吸光度倒數(shù)1/V7.752 4.065 3.472 2.584

6、 1.330得到擬合直線方程：y=3.5275x+0.7246根據(jù)-可得到:=1/0.7246=1.382,*3.5275=4.8712.高精氨酸組底物濃度S (mmol/L)0.500 1.000 1.500 2.000 4.000濃度倒數(shù)1/S2.000 1.000 0.667 0.500 0.250吸光度V0.130 0).259 0.303 0.446 0.624吸光度倒數(shù)1/V7.692 31.861 3.300 2.24,2 1.603得到擬合直線方程：y = 3.4764x + 0.6688根據(jù)一 一 可得至U：=1/0.6688=1.495 ,=*3.4764=5.1983.酚

7、標準曲線分析：由上述圖表來看，在加入高精氨酸抑制酶活性后，酶的Km值增大，Vm值也增大【實驗討論】1. 在實驗過程中，滴加試劑和反應時間的控制一定要準確，以保證得到準確的實驗結(jié)果。2. Km值指最大反應速率一半時底物濃度，它只與酶的結(jié)構(gòu)、 反應物和環(huán)境有關， 而與酶的濃度沒有關系；所以 Km值可以表示酶與底物之間的親和力，Km值越小，親和力越高，越容易反應；反之，值越大，親和力余地，越不易反應。僅供個人參考僅供個人用于學習、研究；不得用于商業(yè)用途。For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commercial