疫苗注冊檢驗及質(zhì)控方法要點

1、1疫苗注冊檢驗及質(zhì)控方法要點李長貴中國食品藥品檢定研究院2013-9-25, 吉林 長春注冊檢驗的內(nèi)容及流程注冊檢驗的內(nèi)容及流程2生產(chǎn)工藝審查：生產(chǎn)工藝審查：“制造及檢定規(guī)程制造及檢定規(guī)程”是否符合基本要求是否符合基本要求 生產(chǎn)及檢定記錄：是否符合制造及生產(chǎn)及檢定記錄：是否符合制造及檢定規(guī)程的描述檢定規(guī)程的描述 制品原液、半成品、成品的檢驗項制品原液、半成品、成品的檢驗項目、方法、結(jié)果是否符合國家藥品標(biāo)目、方法、結(jié)果是否符合國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定準(zhǔn)及企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定 制品包裝、標(biāo)簽、使用說明書是否制品包裝、標(biāo)簽、使用說明書是否符合相關(guān)規(guī)定符合相關(guān)規(guī)定國產(chǎn)疫苗注冊進(jìn)口疫苗注冊生產(chǎn)工藝審查：是

2、否符合基本要求生產(chǎn)工藝審查：是否符合基本要求 制品原液、半成品、成品的檢驗項制品原液、半成品、成品的檢驗項目及方法是否符合我國藥典標(biāo)準(zhǔn)目及方法是否符合我國藥典標(biāo)準(zhǔn) 新的檢測方法是否合理，是否有方新的檢測方法是否合理，是否有方法學(xué)驗證數(shù)據(jù)法學(xué)驗證數(shù)據(jù)按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)檢驗，出具報告書按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)檢驗，出具報告書出具復(fù)核意見：出具復(fù)核意見： 1. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（安全性、有效性）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（安全性、有效性） 2. 檢測方法的科學(xué)性，是否需要改進(jìn)檢測方法的科學(xué)性，是否需要改進(jìn) 3. 其它問題其它問題出具專家意見，補充資料和檢驗試出具專家意見，補充資料和檢驗試劑、參考品等材料，樣品進(jìn)口劑、參考品等材料，樣品

3、進(jìn)口修訂進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)，及修訂依據(jù)修訂進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)，及修訂依據(jù)按照修訂的進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)檢驗按照修訂的進(jìn)口注冊標(biāo)準(zhǔn)檢驗出具報告及復(fù)核意見出具報告及復(fù)核意見 注冊檢驗類型注冊檢驗類型v新產(chǎn)品注冊v工藝變更 核對新工藝（對應(yīng)檢測方法和指標(biāo)） 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)變化v其它變更：規(guī)格，包裝材料 一般不涉及標(biāo)準(zhǔn)和方法的變化v再注冊（進(jìn)口制品） 工藝、方法、標(biāo)準(zhǔn)無變化時，只進(jìn)行核檔v標(biāo)準(zhǔn)提高3原液抽樣檢測原則原液抽樣檢測原則作為成品檢測的補充： 1.在成品中不檢測 裂解劑等工藝中間步驟（滅活、純化疫苗等） 制品的純度、定性等（重組蛋白等） 2.在成品中無法檢測： 聯(lián)合疫苗（多價疫苗？） 佐劑疫苗（殘余DNA、內(nèi)毒素、宿主

4、蛋白等） 根據(jù)以上原則，可以進(jìn)行部分項目的檢測45檢定項目的設(shè)置及其意義檢定項目的設(shè)置及其意義v檢定的意義在于保證制品的： 安全性制品自身：如減毒活疫苗的神經(jīng)毒力 工藝引進(jìn)：流感疫苗的裂解劑，抗生素 工藝殘留：制品殘留，外部污染 后期添加：防腐劑，穩(wěn)定劑 有效性制品的確認(rèn)（鑒別試驗，重組蛋白分子結(jié)構(gòu)） 含量的測定（效力試驗） 穩(wěn)定性或一致性： 上述檢測結(jié)果的分析(正確的指標(biāo)，如活性比) 各級/項檢測標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)間6生物制品生產(chǎn)中檢定項目的設(shè)置生物制品生產(chǎn)中檢定項目的設(shè)置v包括： 1.起始原材料：毒種，細(xì)胞，佐劑，其它添加物質(zhì) 2.生產(chǎn)過程：收獲，純化/提取，裂解等重要工藝過程 3.關(guān)鍵節(jié)點：原液、

5、半成品、成品v緊緊圍繞著制品本身的屬性(類型、使用途徑及目的)、控制節(jié)點，達(dá)到保證制品的質(zhì)量的目的7以流感疫苗生產(chǎn)為例以流感疫苗生產(chǎn)為例雞胚(911日齡)流感病毒工作種子批病毒接種雞胚尿囊腔，培養(yǎng)4872小時病毒收獲（尿囊液）單型病毒收獲液合并病毒滅活病毒超濾濃縮鑒別，病毒滴度，血凝滴度，無菌，支原體內(nèi)毒素，血凝滴度病毒滅活驗證8以流感疫苗生產(chǎn)為例以流感疫苗生產(chǎn)為例病毒液層析純化病毒裂解，超濾再純化除菌過濾單價病毒原液三價半成品成品硫柳汞血凝素含量，無菌鑒別，裂解劑殘留，無菌鑒別，血凝素，無菌，pH裝量，硫柳汞，卵清蛋白，內(nèi)毒素，殘留甲醛，總蛋白異常毒性，外觀9檢測方法的類型檢測方法的類型 v

6、 效力試驗v 鑒別試驗v 安全性測定 1.異常毒性，無菌 2.理化測定：滅活，純化、裂解劑等 3.宿主殘留（蛋白、DNA，BSA） 4.工藝污染:內(nèi)毒素v 裝量，pH，外觀、滲透壓等一般項目10疫苗的類型與效力試驗考慮要點疫苗的類型與效力試驗考慮要點v 減毒活疫苗：OPV,MMR, JE,VZV 等 計算病毒數(shù)量（CFU, PFU, CCID50）,其效力可以預(yù)期臨床使用效果（前提？）v 蛋白或多糖（提取、重組類）疫苗：HBV, HPV,流腦多糖 抗原性，免疫原性: 定性明確，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 體內(nèi)試驗（或由體內(nèi)向體外方法過渡）v 滅活病毒疫苗（包括裂解、純化） 體內(nèi)方法：狂犬疫苗（保護(hù)性抗原不明確）

7、 體外方法：流感疫苗（保護(hù)性抗原明確）11體內(nèi)攻擊模型法體內(nèi)攻擊模型法體內(nèi)功能性抗體檢測體內(nèi)功能性抗體檢測體外免疫學(xué)方法檢測體外免疫學(xué)方法檢測體外分析（理化）方法體外分析（理化）方法與臨床效果的相關(guān)性與臨床效果的相關(guān)性一致性更加明顯一致性更加明顯各類效力試驗方法的意義比較12以HPV 疫苗效力試驗為例v Merck疫苗：體外方法 夾心ELISA方法測定抗原含量，其中第二個抗體針對中和表位v GSK疫苗：簡化的體內(nèi)方法 疫苗及參考品稀釋后，采用單一劑量免疫小鼠，以間接ELISA法測定抗體滴度，計算疫苗和參考品的比值v 國產(chǎn)疫苗：體內(nèi)方法 疫苗系列稀釋后免疫小鼠，每組10只鼠，采血測定假病毒中和抗

8、體，計算半數(shù)感染劑量（ED50法）完全的體外方法完全的體外方法簡單的體內(nèi)法，簡單的體內(nèi)法，抗體為非功能性抗體為非功能性完整的體內(nèi)法，完整的體內(nèi)法，抗體為功能性抗體為功能性13體內(nèi)方法和體外方法的比較體內(nèi)方法和體外方法的比較優(yōu)點缺點體內(nèi)法可以發(fā)現(xiàn)潛在的抗原完整性的變化，尤其是當(dāng)進(jìn)行攻擊試驗或測定功能性抗體的情況下1.變異大（試驗有效的比例較低）2.試驗周期長（數(shù)周或數(shù)月）3.費用高4.不符合3R原則（replacement, reduction, refinement）體外法1.變異小2.試驗周期短（數(shù)小時或數(shù)天）3.費用較低4.符合3R原則1.制品原因，可能無法建立，或與體內(nèi)法一致性差2.可能

9、無法區(qū)分抗原完整性的微小差異。14體內(nèi)效力試驗的局限性體內(nèi)效力試驗的局限性v 不同動物種屬（品系）免疫應(yīng)答不同：采用攻擊模型難以預(yù)期保護(hù)效果v 商業(yè)化疫苗的質(zhì)量保證： GMP 經(jīng)過驗證的生產(chǎn)工藝 中間過程控制和放行檢測v 批簽發(fā)中的效力試驗用于： 確認(rèn)生產(chǎn)過程的一致性 確保商業(yè)化的批次與臨床試驗批次無差異，后者經(jīng)過臨床 試驗證明其安全性及有效性15效力試驗的策略v在制品的研發(fā)階段采用體內(nèi)和體外兩種方法 ： 建立疫苗抗原性和穩(wěn)定性的數(shù)據(jù) 建立體內(nèi)和體外方法的相關(guān)性 確認(rèn)體外方法監(jiān)測疫苗穩(wěn)定性的適用性v上市后的效力試驗常規(guī)放行檢測采用體外方法常規(guī)穩(wěn)定性監(jiān)測： 若可行（前期驗證）采用體外方法 經(jīng)常進(jìn)

10、行體內(nèi)方法以保持技術(shù)熟練驗證工藝的重大變更采用體內(nèi)和體外兩種方法 16流感疫苗血凝素檢測方法單向免疫擴散(SRID) 依賴于WHO提供的：抗原參考品抗血清參考品根據(jù)每年流行毒株的變化制備相應(yīng)的參考品問題：在流感疫苗的檢定中，為何采用這樣一個古老的方法？17體內(nèi)效力試驗選擇合適的免疫程序v 免疫針次優(yōu)選單劑次免疫，多劑次免疫應(yīng)有足夠的理由v 疫苗的劑量免疫應(yīng)答應(yīng)當(dāng)落在劑量效應(yīng)范圍內(nèi)v 劑量效應(yīng)曲線應(yīng)當(dāng)通過多次試驗確認(rèn)v 證明檢測的敏感性應(yīng)能夠發(fā)現(xiàn)制品的降解及效力下降（重要） 如某個制品，免疫動物后測定陽轉(zhuǎn)率，不同劑量同一標(biāo)準(zhǔn)18多價疫苗中的劑量效應(yīng)曲線對所有抗原的劑量效應(yīng)范圍為0.1 g 0.5

11、g19效力試驗標(biāo)準(zhǔn)效期內(nèi)下降值效期內(nèi)下降值生產(chǎn)時目標(biāo)生產(chǎn)時目標(biāo)疫苗注冊中發(fā)現(xiàn)的問題舉例疫苗注冊中發(fā)現(xiàn)的問題舉例v國產(chǎn)聯(lián)苗注冊 麻疹風(fēng)疹腮-水痘四聯(lián)苗：在水痘滴定中，采用人二倍體細(xì)胞，但麻疹、風(fēng)疹及腮腺炎病毒均可以在人二倍體細(xì)胞上生長，應(yīng)當(dāng)有方法學(xué)驗證，證明無干擾v國產(chǎn)HPV疫苗效力試驗： 采用ED50方法，建立了標(biāo)準(zhǔn)，例如ED50小于0.1g， 但沒有參考疫苗，方法無法準(zhǔn)確評估v進(jìn)口HPV疫苗變更注冊 提出變更申請，將體內(nèi)方法變?yōu)轶w外方法，提供了驗證 資料，但該佐劑疫苗無明顯的解吸附過程，樣品及參考疫苗解吸附不充分，建議維持原體內(nèi)法20疫苗注冊中發(fā)現(xiàn)的問題v 三批制品的定義： 從原材料開始，還

12、是僅為配制階段v 制品的均一性：小量生產(chǎn)，均一性 BSA檢測，鑒別試驗v 原液送樣過程中污染v 菌毒種來源是否合法（前期合同檢驗）v 規(guī)程描述不清楚，省略關(guān)鍵環(huán)節(jié)2122參考品v參考品是檢測方法，尤其是疫苗中的效力試驗的重要組成部分v參考品作用： 1.建立每次試驗是否有效的標(biāo)準(zhǔn)（內(nèi)控） 如減毒活疫苗的參考品，每次檢測在標(biāo)識值2SD范圍內(nèi)，試驗有效，樣品測定結(jié)果準(zhǔn)確。 2.用于校正疫苗中活性單位 如流感疫苗的血凝素含量參考品，以單向免疫擴散試驗，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定疫苗樣品中抗原含量23參考品的建立v需要考慮的因素1.用途：方法評價&質(zhì)控/一般試驗/效力試驗2.使用范圍：一個單位全國國際3

13、.標(biāo)定方法：根據(jù)用途、使用范圍而定4.溯源：v制備要求1.與樣品關(guān)系2.分裝與保存3.標(biāo)定：是否協(xié)作研究參考品的制備需要全面考慮上述因素，制訂合理的策略該簡單的就簡單，該復(fù)雜的就復(fù)雜24舉例1：卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的建立25主要用途和思路主要用途和思路二、制備策略二、制備策略1.1.以國外試劑盒進(jìn)行標(biāo)定，從而與以往結(jié)果一致以國外試劑盒進(jìn)行標(biāo)定，從而與以往結(jié)果一致2.2.對卵清蛋白進(jìn)行篩選對卵清蛋白進(jìn)行篩選3.3.制備不同濃度系列，方便使用制備不同濃度系列，方便使用4.4.對保護(hù)劑進(jìn)行篩選和考核對保護(hù)劑進(jìn)行篩選和考核5.5.以國外試劑盒進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定以國外試劑盒進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定不需要申報國家參考品，液體分裝

14、，不需要分裝精密性，不需要長期穩(wěn)定性考核一、用途：一、用途：用于評價國產(chǎn)卵清蛋白試劑盒，以取代國外試劑盒用于評價國產(chǎn)卵清蛋白試劑盒，以取代國外試劑盒26原材料初篩結(jié)果序號序號品牌品牌/級別級別/純度純度/來源來源配制配制濃度濃度進(jìn)口試劑進(jìn)口試劑復(fù)核復(fù)核Lowry法法復(fù)核復(fù)核1 1Sigma G1mg/ml1mg/ml1.1831.1830.88310.88312 2Sigma G98%1mg/ml1mg/ml1.3671.3670.93890.93893 3Sigma G1mg/ml1mg/ml1.2241.2240.885320.885324 4Sigma G 99%1mg/ml1mg/ml

15、1.5081.5081.018621.0186227 稀釋液稀釋參考品穩(wěn)定性示意圖00.511.522.52512.56.253.131.56卵清蛋白含量（ng/ml）O.D4373天377天28卵清蛋白國家定量參考品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果系列參考品理論值(ng/ml)實驗室內(nèi)參考品標(biāo)示值實驗室1(n=8)實驗室2(n=8)實驗室3(n=8)均值CV(%)均值CV(%)均值CV(%)均值CV(%)1517.60118.02419.10617.96 31011.67612.20712.89212.25656.41116.6757.2956.7982.53.0473.0633.2333.11529標(biāo)定結(jié)論標(biāo)

16、定結(jié)論 經(jīng)標(biāo)定，系列參考品標(biāo)示經(jīng)標(biāo)定，系列參考品標(biāo)示量分別為：量分別為：S1：17.96 ng/ml（95%CI:16.9618.96）S2：12.25 ng/ml（95%CI:10.7413.76） S3：6.79 ng/ml（95%CI:5.657.93） S4：3.11ng/ml（95%CI:2.803.42） 30對天壇試劑驗證結(jié)果參考品準(zhǔn)確度精密度編號標(biāo)示量測量值回收率%CV%S117.96117.09954S212.251.5112.09993S36.791.146.09902S43.110.312.84915相關(guān)系數(shù)r20.9971單位：單位：(ng/ml)31對天壇試劑熱穩(wěn)定性

17、驗證結(jié)果參考品準(zhǔn)確度精密度編號標(biāo)示量測量值回收率%CV%S117.96116.99953S212.251.5112.08993S36.791.146.24925S43.110.312.94953相關(guān)系數(shù)r20.9967單位：單位：(ng/ml)32對科興試劑驗證結(jié)果準(zhǔn)確度精密度參考品標(biāo)示值測量值回收率%CV%17.96118.36102612.251.5113.1610766.791.146.8310183.110.313.039712相關(guān)系數(shù)r20.9948單位：單位：(ng/ml)33對科興試劑熱穩(wěn)定性驗證結(jié)果準(zhǔn)確度精密度參考品標(biāo)示值測量值回收率%CV%17.96117.2396412.2

18、51.5112.2810056.791.146.469543.110.312.93946相關(guān)系數(shù)r20.9957單位：單位：(ng/ml)企業(yè)企業(yè)201020102011201120122012北京天壇236.0 143.0 21.0 北京科興42.026.0 24.0 雅立峰17.06.015.0 長春所75.011.0 8.0長春長生150.0 77.0 16.0 上海所11.0 4.02.0浙江天元143.0 24.0 40.0 華蘭生物28.0 13.0 10.0 蘭州所67.0 80.0/巴斯德37.063.0 61.0 史克10.08.08.0 諾華109.0203.0/蘇威259

19、.080.031.0應(yīng)用效果20102012年流感疫苗卵清含量明顯下降！檢測結(jié)果為ng/ml, 藥典標(biāo)準(zhǔn)500ng/ml35舉例2：麻疹減毒活疫苗參考品的建立36減毒活疫苗參考品的意義v參考品是病毒滴定系統(tǒng)中的重要組成部分，參考品是病毒滴定系統(tǒng)中的重要組成部分，能夠控制不同滴度試驗間的變異，是病毒能夠控制不同滴度試驗間的變異，是病毒滴度測定中不可或缺的部分。滴度測定中不可或缺的部分。 v使用國家參考品能夠為相關(guān)產(chǎn)品提供統(tǒng)一使用國家參考品能夠為相關(guān)產(chǎn)品提供統(tǒng)一的參照標(biāo)準(zhǔn)，使生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控部門更好的參照標(biāo)準(zhǔn)，使生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控部門更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量的控制產(chǎn)品質(zhì)量。37參考品的制備、標(biāo)定方案參考品的制

20、備、標(biāo)定方案u選取國內(nèi)生產(chǎn)用毒株選取國內(nèi)生產(chǎn)用毒株( (滬滬191/BRD) )制備參考品；制備參考品； u為了增加參考品的為了增加參考品的均一性均一性和和穩(wěn)定性穩(wěn)定性，在參考品的，在參考品的制備過程中制備過程中提高對保護(hù)劑成份、分裝精度、殘余提高對保護(hù)劑成份、分裝精度、殘余水分含量的要求水分含量的要求；u協(xié)作標(biāo)定包括所有相關(guān)疫苗生產(chǎn)企業(yè)，以保證協(xié)協(xié)作標(biāo)定包括所有相關(guān)疫苗生產(chǎn)企業(yè)，以保證協(xié)作標(biāo)定結(jié)果的作標(biāo)定結(jié)果的代表性代表性；u將協(xié)作標(biāo)定分兩個階段，預(yù)標(biāo)定和正式標(biāo)定，以將協(xié)作標(biāo)定分兩個階段，預(yù)標(biāo)定和正式標(biāo)定，以保證協(xié)作標(biāo)定保證協(xié)作標(biāo)定準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性 ；u與與國際參考品同時進(jìn)行標(biāo)定，保證國家參考品的國際參考品同時進(jìn)行標(biāo)定，保證國家參考品的溯源性溯源性；u 穩(wěn)定性考核包括熱穩(wěn)定性和實時穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考核包括熱穩(wěn)定性和實時穩(wěn)定性。選擇毒株選擇毒株生產(chǎn)制備生產(chǎn)制備正式標(biāo)定正式標(biāo)定穩(wěn)定性考核穩(wěn)定性考核預(yù)標(biāo)定預(yù)標(biāo)定不含國際參考品，修訂檢測方法含國際參考品，按照統(tǒng)一方法38協(xié)作標(biāo)定流程圖發(fā)放調(diào)查表（含標(biāo)定SOP）獲得反饋結(jié)果修改SOP發(fā)送候選參考品和國際參考品候選參考品預(yù)標(biāo)定預(yù)標(biāo)定結(jié)果匯總及分析正式標(biāo)定（候選參考品國際參考品）正式標(biāo)定結(jié)果匯總及分析39標(biāo)定方案示意圖4