種子制備和菌種保藏

1、第三章第三章 種子制備與菌種保藏種子制備與菌種保藏第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、種子制備一、種子制備種子制備是抗生素發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序，也是重要的工序。定義：定義：利用生產(chǎn)菌種，在一定的條件下，經(jīng)過擴(kuò)大繁殖，成為具有一定質(zhì)量和數(shù)量的純種，供給抗生素生產(chǎn)使用。包括兩個過程： 孢子制備孢子制備：生產(chǎn)大量孢子 搖瓶種子制備搖瓶種子制備：生產(chǎn)大量種子菌絲又可分為：實驗室制備階段與生產(chǎn)車間制備階段二、菌種保藏菌種保藏目的：目的：保持菌種的生活力及其優(yōu)良性能斜面沙土管冷干管液氮管實驗室種子制備生產(chǎn)現(xiàn)場種子制備 二級斜面一級斜面 米孢子 母瓶 子瓶 一級種子罐 發(fā)酵罐 二級種子罐 三級種子罐菌種保藏生產(chǎn)種子

2、制備的一般流程生產(chǎn)種子制備的一般流程幾個概念幾個概念1. 種子罐級數(shù)種子罐級數(shù)：種子在種子罐中需擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。 種子罐級數(shù)確定根據(jù)：（1）菌種生長特性（2）孢子數(shù)量（3）孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度（4）發(fā)酵罐的接種量2. 發(fā)酵級數(shù)：發(fā)酵級數(shù)：種子罐的級數(shù)加一。二級發(fā)酵，即一級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如青霉素，四環(huán)素；三級發(fā)酵，即二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如紅霉素、慶大霉素；四級發(fā)酵，即三級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，如鏈霉素。種子級數(shù)愈少，愈有利于簡化工藝和控制，并減少了因多次接種而產(chǎn)生污染的機(jī)會。3. 接種齡：接種齡：生產(chǎn)種子的培養(yǎng)時間，即指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐的培養(yǎng)時間。接種齡以菌絲處于生命力極

3、為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達(dá)到最高峰時為宜。4. 接種量接種量：指移入的種子液體積與接種后培養(yǎng)液體積比例。最適接種量為715%。第二節(jié)第二節(jié) 種子制備種子制備 一、一、 斜面種子的制備斜面種子的制備1. 斜面種子：斜面種子：在試管或扁瓶內(nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面上生長的菌種培養(yǎng)物。2. 制備流程：制備流程：3. 制備過程注意事項制備過程注意事項 ： (1) 瓊脂要完全浸沒在營養(yǎng)液內(nèi),用量1.0%-2.5% (2) 營養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 裝量掌握在斜面頂端不超過試管或扁平長度的2/3； (4) 滅菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以減少冷凝水 (5) 微量元素先配制成

4、一定的溶液，用移液管定量加入在無菌間超凈工作臺進(jìn)行接種操作在無菌間超凈工作臺進(jìn)行接種操作 3. 質(zhì)量檢查質(zhì)量檢查 （1）外觀檢查（菌落的形態(tài)、色澤、稀密度、孢子量、色素分泌）（2）無菌檢查（3）搖瓶生產(chǎn)能力檢查 4. 影響斜面種子質(zhì)量的因素影響斜面種子質(zhì)量的因素 (1)原材料質(zhì)量，水質(zhì)，培養(yǎng)基pH (2)滅菌條件 (3)接種量 (4)培養(yǎng)室溫度、濕度、通風(fēng) (5)培養(yǎng)時間 (6)有害氣體或揮發(fā)物（培養(yǎng)室內(nèi)不要安紫外燈） (7) 冷藏條件二二 、米粒種子（米孢子）、米粒種子（米孢子） 1. 米孢子：米孢子：將霉菌或放線菌接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時間后產(chǎn)生的分生孢子。2. 米孢

5、子制備工藝流程米孢子制備工藝流程3. 制備過程注意事項制備過程注意事項（1）浸泡時間及加營養(yǎng)液量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透但不粘連； （2）分裝量應(yīng)掌握在平鋪后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培養(yǎng)前期應(yīng)經(jīng)常搖動米粒，使微生物在米粒表面生長均勻，氣生菌絲及孢子長成后不再搖動。 （5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存 4. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) （1）無雜菌污染 （2）孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高 （3）生產(chǎn)能力高 (4) 真空干燥后含水量小于10%5. 影響質(zhì)量的因素及控制影響質(zhì)量的因素及控制（同前）三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米

6、糠等，其余同米粒種子）米粒種子）四、搖瓶種子四、搖瓶種子 1.搖瓶種子搖瓶種子 : 將斜面種子或米孢子接種于錐形搖瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子。 2.制備流程制備流程 : 3.制備過程注意事項制備過程注意事項 1) 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量應(yīng)較斜面豐富，以確保一定的營養(yǎng)菌體生長量；能保持生長過程中pH穩(wěn)定。2) 培養(yǎng)基裝量適當(dāng)，以保證良好的通氣并與發(fā)酵罐通氣條件相適應(yīng)；參考裝量為40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厭氧培養(yǎng)，則裝量應(yīng)增加一倍以上；3) 滅菌時

7、要注意不要讓蒸汽冷凝水打濕或粘污培養(yǎng)基在瓶塞或紗布上4）注意搖床轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速越快，偏心距越大，通氣越好。經(jīng)常檢查，皮帶松弛時要緊一緊。 5） 注意搖床中心與邊緣、上層與下層的溫差 搖瓶種子制備流程搖瓶種子制備流程3.質(zhì)量檢查質(zhì)量檢查：( 1) 菌體濃度：外觀稠度，靜置沉降率，離心沉降率。( 2) 菌體生長階段：顯微鏡檢查細(xì)胞分化情況。( 3) 代謝情況：對殘余糖、氮進(jìn)行化學(xué)分析，并測量pH值。( 4) 生產(chǎn)能力：搖瓶發(fā)酵試驗。( 5) 污染雜菌情況：鏡檢及無菌試驗檢查 4. 影響質(zhì)量的因素影響質(zhì)量的因素 五、發(fā)酵罐種子五、發(fā)酵罐種子1.制備流程制備流程 ： 斜面、搖瓶或米粒種斜面、搖瓶或米粒種子

8、子 培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制 實罐或連續(xù)滅菌實罐或連續(xù)滅菌 冷卻冷卻 火圈或壓力差接種火圈或壓力差接種 培養(yǎng)培養(yǎng) 發(fā)酵罐種子發(fā)酵罐種子 2 .2 .制備過程注意事項制備過程注意事項1)培養(yǎng)基要求與發(fā)酵培養(yǎng)基大致相同，較搖瓶培養(yǎng)基豐富，控制培養(yǎng)基成份的合理配比2) 接種方式：一級種子罐：火圈保護(hù)接種法火圈保護(hù)接種法和壓差法壓差法二級種子罐：壓差法：壓差法3）通氣培養(yǎng)時通入空氣的溫度適中（20-50），攪拌轉(zhuǎn)速也要適當(dāng)。4）采用夾套或蛇管冷卻以保持恒溫，溫度不能高于控制溫度，防止造成異常發(fā)酵5） 通過培養(yǎng)基中生理酸堿性物質(zhì)的配比，使pH自然維持在適宜的范圍 6）控制合適移種量： 確定合適的移種量：過大

9、或過小都對發(fā)酵有不利影響 掌握種子罐的放罐體積。壓差法接種操作示意種子罐1 發(fā)酵罐1 發(fā)酵罐2種子罐2移種方式：移種方式：1）單種2）雙種3）倒種4）混種3.3.質(zhì)量檢查及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)量檢查及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：1）不污染雜菌 2 2）菌體生長階段（種齡）：處于對數(shù)生長期后期，菌體量未達(dá)到高峰3）菌體濃度： 菌體濃度的測定方法：離心沉淀法、光密度法、細(xì)胞記數(shù)法等4）糖、氮、磷代謝情況5）種子液pH 6）搖瓶試驗的發(fā)酵水平7）特異性酶活力種齡對發(fā)酵的影響種齡對發(fā)酵的影響4. 影響質(zhì)量的因素影響質(zhì)量的因素5. 種子代謝緩慢種子代謝緩慢原因分析分析 空氣溫度偏低 局部燙傷 培養(yǎng)基原材料質(zhì)量差 培養(yǎng)基滅菌溫度太

10、高，營養(yǎng)成分破壞多 無機(jī)磷量低 接種量太小 前一級種子質(zhì)量太差 泡沫多通氣差第三節(jié)第三節(jié) 菌種保藏菌種保藏定義：定義： 將有用的微生物以特定培養(yǎng)形態(tài)在特定的環(huán)境條件下存放，以保持種的存活、純粹和遺傳性狀的穩(wěn)定。一、條件及原理一、條件及原理 1. 低營養(yǎng)2. 干燥3. 隔氧4. 低溫 降低代謝速率或使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)(孢子、芽孢等）5. 密封 保持干燥、隔氧、純粹 二、常用的菌種保藏方法二、常用的菌種保藏方法1.單純傳代保存法（斜面或穿刺）單純傳代保存法（斜面或穿刺）斜面法：斜面法：實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，適用于細(xì)菌或酵母。適用于細(xì)菌或酵母。方法：從沙土管、安瓿管或其它藏物內(nèi)取出少量菌種

11、或制成懸浮液接入新鮮的斜面上，在一定的溫度下培養(yǎng)，生長成熟后，2-4冰箱保存。優(yōu)點優(yōu)點：是操作簡單，使用方便缺點缺點：是保存期短，在不斷的傳代過程中，菌種容易變異，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會亦較多。2. 結(jié)合單孢子分離的傳代保存法結(jié)合單孢子分離的傳代保存法斜面孢子懸浮液稀釋涂布單細(xì)胞分離培養(yǎng)挑菌高產(chǎn)菌株的篩選高產(chǎn)菌株的保藏4冰箱，3-6個月 適用于適用于遺傳不穩(wěn)定的菌種遺傳不穩(wěn)定的菌種, 既保藏了菌種，又保持了生產(chǎn)能力3. 石蠟油封藏法石蠟油封藏法方法：方法：在長好菌的斜面試管中，加入滅過菌的液體石蠟，可防止培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)，隔絕培養(yǎng)物與氧的接觸，從而降低

12、微生物的代謝活動，推遲細(xì)胞老化，延長保存時間。優(yōu)點：優(yōu)點：保存期比斜面低溫法保存時間長，適用范圍廣，真菌、真菌、放線菌放線菌都適用。4. 沙土管保存沙土管保存保存抗生素生產(chǎn)菌常用的方法，目前使用最廣泛的保藏方法。優(yōu)點：優(yōu)點：效果好，操作方便，保存期可達(dá)一年以上方法：方法：將處理過的細(xì)沙與土按1：2混合，分裝沙土管中1cm高，加棉塞，于121 滅菌1h，間歇滅菌3-5次。接孢子懸液于沙土管中，抽真空。干燥后于4冰箱中保存。1-3年保存期。適用于適用于霉菌、放線菌和形成芽孢的細(xì)菌霉菌、放線菌和形成芽孢的細(xì)菌的保藏的保藏5. 米孢子保存米孢子保存步驟與米孢子的制備類似密封，4冰箱3-6個月；真空抽干

13、后密封，保藏6-12個月。 適用于適用于霉菌霉菌的保藏的保藏6. 低溫凍結(jié)保藏法低溫凍結(jié)保藏法將保存的菌種（孢子或菌體）懸浮于滅菌的10%-20%甘油或二甲亞基亞砜保護(hù)劑中，低溫冰箱（-20 -70）凍結(jié)。保存溫度視菌種不同而異，保存期1-2年。優(yōu)點：優(yōu)點：存活力高，變異率低，使用方便7. 冷凍干燥管保存（冷凍干燥管保存（lyophilization freeze-drying )原理：原理：在較低的溫度下，即-15 以下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并且利用保護(hù)劑（脫脂牛奶或血清）保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。因此微生物一般可保存5-1

14、0年。優(yōu)點：優(yōu)點：保存時間長，存活力高，變異率低缺點：缺點：制備工藝較復(fù)雜，需要保護(hù)劑、真空干燥和冷藏設(shè)備，費(fèi)用較貴。方法：方法：收集菌種 滅菌脫脂牛奶或馬血清作為懸浮介質(zhì) 滅菌安瓿管 預(yù)凍 低溫真空凍干 密封， 適用于適用于一切微生物一切微生物的保存的保存。 細(xì)胞 10%-20%甘油作為懸浮介質(zhì) 分裝入安瓿瓶內(nèi) 預(yù)凍 置液氮內(nèi)（-196）， 適用于適用于所有微生物、動物和植物細(xì)胞所有微生物、動物和植物細(xì)胞的保存的保存8. 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法原理：原理：微生物在-130 的低溫下，所有的代謝活動都暫停而生命 延續(xù)，微生物菌種得以長期保存。保存期：515年。優(yōu)點：優(yōu)點：存活率高，穩(wěn)

15、定性強(qiáng)，保存期最長，適用范圍最廣缺點缺點：需具備液氮和超低溫冷凍條件，不易推廣，一般保存經(jīng)濟(jì)價值較高的菌種。方法：方法：9、基因工程菌的保藏、基因工程菌的保藏 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長非必需。 一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。 當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。 我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第四節(jié)第四節(jié) 菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種保藏機(jī)構(gòu)的簡介菌種

16、是一個國家的重要生物資源，所以菌種保藏是一項重要的菌物學(xué)工作。隨著科技的進(jìn)步和生產(chǎn)的發(fā)展，對菌物資源的利用正在不斷擴(kuò)大，所以菌種保藏工作顯得更加重要。目的：目的：廣泛收集實驗室和生產(chǎn)菌種，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂和便于研究、交換、使用的目的。以下是幾個國際上規(guī)模較大的菌種保藏機(jī)構(gòu)：以下是幾個國際上規(guī)模較大的菌種保藏機(jī)構(gòu)：美國典型培養(yǎng)物保藏所(ATCC，American Type Culture Collection，Maryland，USA)美國農(nóng)業(yè)部北方地區(qū)研究中心（NRRL，Northron Regional Reseach Center Laboratory，Agricu

17、ltural Research Service. U.S. Department of Agriculture, Peria, Illinois,USA)英聯(lián)邦國際菌物研究所（CMI）英國國家酵母菌保藏所（NCYC）荷蘭菌物菌種中心保藏所（CBS）日本大阪發(fā)酵研究所（IFO）中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，China Center for Type Culture Collection）是中國專利局指定的用于專利程序培養(yǎng)物的保藏機(jī)構(gòu)，成為國內(nèi)保存專利培養(yǎng)物數(shù)量最多，種類最全的保藏機(jī)構(gòu)。中國微生物菌種保藏中心中國微生物菌種保藏中心中心名稱中心名稱縮寫縮寫所在地所在地郵碼郵碼保藏范圍保藏范圍中

18、國典型培養(yǎng)物保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心 普通微生物菌種保藏中心普通微生物菌種保藏中心 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心 工業(yè)微生物保藏中心工業(yè)微生物保藏中心 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心心 抗生素菌種保藏管理中心抗生素菌種保藏管理中心 獸醫(yī)微生物菌種保藏中心獸醫(yī)微生物菌種保藏中心 林業(yè)微生物菌種保藏中心林業(yè)微生物菌種保藏中心 CCTCC CCGMC ACCC CICC CMCC CACC CVCC CFCC武漢大學(xué)武漢大學(xué) 中國科學(xué)院微生物研究所中國科學(xué)院微生物研究所中國科學(xué)院病毒研究所中國科學(xué)院病毒研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所土壤肥料研究所輕工部食品發(fā)酵工業(yè)研究所輕工部食品發(fā)酵工業(yè)研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所皮膚病研究所中國藥品生物制品檢定所中國藥品生物制品檢定所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家醫(yī)藥管理局國家醫(yī)藥管理局四川抗生素工業(yè)研究所四川抗生素工業(yè)研究所華北制藥廠抗生素研究所華北制藥廠抗生素研究所農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 中國林業(yè)研究所中國林業(yè)研究所武漢武漢430072 北京北京100080武漢武漢430071 北京北京100081 北京北京100027 南京南京210