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1、中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù) 第15卷 第12期 20110319出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 19, 2011 Vol.15, No.12靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性*梁 爽,李 權(quán),唐休發(fā),馮 揚(yáng),何等旗23Cytocompatibility of electro-spinning nano-fibrous scaffolds for skeletal muscle tissue engineeringLiang Shuang1, Li Quan1, T

2、ang Xiu-fa2, Feng Yang1, He Deng-qi3AbstractLiang S, Li Q, Tang XF, Feng Y, He DQ.Cytocompatibility of electro-spinning nano-fibrous scaffolds for skeletal muscle tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(12):2171-2174. State Key Laboratory of Oral Disease, Che

3、ngdu 610041, Sichuan Province, China; 2Department of Head and Neck Oncology, West China College ofStomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3Department of Stomatology, the Second Affiliated Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, ChinaLiang Shu

4、ang, Studying for masters degree, State Key Laboratory of Oral Disease, Chengdu 610041, Sichuan Province, China nancy1986xx Correspondence to: Tang Xiu-fa,Professor, Doctoral supervisor,Department of Head and Neck Oncology, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichu

5、an Province, ChinaSupported by: Doctor Subject Foundation of the Ministry of Education of China, No.20050610077*; the National Natural Science Foundation of China, No. 30872890*Received: 2010-10-15 Accepted: 2010-11-21摘要梁爽,李權(quán),唐休發(fā),馮揚(yáng),何等旗.靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性J.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(12):2171-21

6、74. 0 引言骼肌組織工程的需要7-11。研究表明,采用靜電紡絲技術(shù)制得的無紡布具有孔隙率高、表面積大、均一性好等特點(diǎn),并可從納米尺度模仿天目前人們已利用組織工程技術(shù)獲得了組織然的細(xì)胞外基質(zhì),促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖。本實(shí)驗(yàn)擬初步探討利用電紡技術(shù)制備聚乳酸、蠶絲蛋白和膠原共混物支架材料的細(xì)胞相容性。1 材料和方法 設(shè)計(jì):隨機(jī)對(duì)照細(xì)胞學(xué)體外實(shí)驗(yàn)。 時(shí)間及地點(diǎn):于2009-02/05在口腔疾病研工程化皮膚1-3、骨組織和軟骨組織等4-6,有部分工程化組織進(jìn)行了臨床試用,獲得了初步成果3。關(guān)于骨骼肌組織工程支架材料,目前文獻(xiàn)已報(bào)道很多種。有學(xué)者報(bào)道以生物可降解的

7、膠原盤,也有以聚L-乳酸、聚羥基乙酸、聚L-乳酸/聚羥基乙酸共聚物等作為骨骼肌組織工程的支架材料,各有優(yōu)缺點(diǎn),不能完全滿足骨ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 2171www.CRTER.org 1 梁爽,等. 靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性 口腔疾病研究國(guó) 家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四 川 省 成 都 市 2 610041; 華西口 腔醫(yī)院頭頸腫瘤 外科, 四川省成都 市 610041; 3 蘭 州大學(xué)第二附屬 醫(yī)院口腔科, 甘肅 省 蘭 州 市 730030 梁爽, 1986 女, 年生,重慶市人, 漢族, 四川大學(xué)華 西口腔

8、醫(yī)學(xué)院在 讀碩士, 主要從事 骨骼肌組織工程 支架材料研究。 nancy1986xx 通訊作者:唐休 發(fā),教授,博士生 導(dǎo)師, 華西口腔醫(yī) 院頭頸腫瘤外科, 四川省成都市 610041 中圖分類號(hào):R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1673-8225 (2011)12-02171-04 收稿日期: 2010-10-15 修回日期: 2010-11-21 (20101015005/GW Y) 究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。 材料: 出生3 d內(nèi)的雄性SD乳鼠購(gòu)自四川大 學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。不同組分靜電紡絲納米纖維 膜由四川大學(xué)生物材料實(shí)驗(yàn)室提供。將靜電紡 絲納米纖維膜分為以下7組:純聚乳酸組、60% 聚乳

9、酸+30%蠶絲蛋白+10%膠原組、60%聚乳 酸+40%蠶絲蛋白組、70%聚乳酸+30%蠶絲蛋 白組、 80%聚乳酸+10%蠶絲蛋白+10%膠原組、 80%聚乳酸+20%蠶絲蛋白組、70%聚乳酸+ 20%蠶絲蛋白 + 10%膠原組。 實(shí)驗(yàn)方法: 成肌細(xì)胞的制取與培養(yǎng): 參照Blau等 12-13 材料的細(xì)胞相對(duì)數(shù)。取每組余下孔中材料,洗 滌,置2.5%戊二醛4 過夜。不同濃度乙醇梯 度脫水后置醋酸異戊酯中置換,掃描電鏡檢測(cè) 成肌細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)材料中的黏附情況。 黏附率=實(shí)驗(yàn)材料組平均吸光度/對(duì)照組平均吸光度 主要觀察指標(biāo):成肌細(xì)胞在各組材料的黏 附及生長(zhǎng)情況。 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 分 析 : 采 用 SP

10、SS 11.5 進(jìn) 行 ANOVA分析和LSD分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析由第一、 的方 二作者同完成。 2 2.1 結(jié)果 成肌細(xì)胞的培養(yǎng)情況 在倒置顯微鏡下 法,無菌條件下分離SD雄性乳鼠四肢肌肉, PBS液洗后置于雙抗,剪碎成1 mm3大小,移 入培養(yǎng)瓶,膠原酶和胰蛋白酶分3次消化。收集 細(xì)胞懸液,終止消化。離心,取沉淀,制成細(xì) 胞懸液,差速貼壁3次。以1×10 L 濃度接種于 培養(yǎng)瓶中,在37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱培 養(yǎng)。3 d后換液,后每隔2 d換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶 底80%時(shí)傳代。 靜電紡絲納米纖維膜浸提液的制備:無菌條件 7 -1 可見差速貼壁后的培養(yǎng)瓶底有明顯的細(xì)胞貼 壁 生 長(zhǎng)

11、 。 培養(yǎng) 基 中 見 大量 懸 浮 細(xì) 胞 (呈 圓 球 形)。30 min后開始貼壁,48 h貼壁完全。貼 壁后的成肌細(xì)胞雙極伸展、呈長(zhǎng)梭形、單核、 有折光性。三四天后,細(xì)胞排列規(guī)律、相互平 行,并有集落樣細(xì)胞生長(zhǎng)。 2.2 靜 電 紡絲 納 米 纖維膜 的 細(xì) 胞毒性 實(shí) 驗(yàn) 由圖1生長(zhǎng)曲線可以看出成肌細(xì)胞在接種后的 第1天處于恢復(fù)期。在第一二天時(shí)細(xì)胞數(shù)量增 加較少。從第2天開始便進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期,直 到第4天。 第五六天為平臺(tái)期。 第6天以后細(xì)胞 數(shù)量開始下降,說明成肌細(xì)胞進(jìn)入衰退期。 取各組靜電紡絲納米纖維膜,剪碎移至6孔板。 每 組 3 個(gè) 培 養(yǎng) 板 。 每 孔 材 料 面 積 為

12、 10 mm× 60 mm。按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)之醫(yī)療器 械生物學(xué)評(píng)價(jià)的第12部分樣品制備與參照樣 品(GB/T 16886.2-2005) 14 ,以含體積分?jǐn)?shù)20% 新生小牛血清的培養(yǎng)基作為浸提介質(zhì)(每6 cm2 材料/1 mL浸提介質(zhì))。浸提條件(37±1) , 24 h。每組獲18 mL浸提液。移入無菌玻璃瓶, 標(biāo)記,置于4 冰箱備用。 MTT比色法檢測(cè)靜電紡絲納米纖維膜的細(xì)胞毒 性:取第3代成肌細(xì)胞按2×10 L 的濃度接種于 7 -1 2 1.2 0 1.0 group 1 2 Mean A value 96孔板(200 µL/孔),培養(yǎng)

13、24 h。將各組靜電紡 絲納米纖維膜浸提液及對(duì)照組(加體積分?jǐn)?shù)20% 新生小牛血清的F12培養(yǎng)基)加入到96孔板(橫 向12孔為同組浸提液)。于培養(yǎng)1,2,3,4,5, 6 d時(shí)分別取出每組4個(gè)孔的細(xì)胞,在570 nm波 長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度(A值)值,結(jié)果以x±s表示, 并繪制生長(zhǎng)曲線。 靜電紡絲納米纖維膜預(yù)處理及接種成肌細(xì)胞: _ 8 0.8 6 0.6 3 4 4 0.4 5 6 7 8 2 0.2 0 0.0 1 2 3 4 Time (d) 5 6 將各組靜電紡絲納米纖維膜浸提液經(jīng)紫外光照 射及預(yù)濕處理,每組材料設(shè)計(jì)成5復(fù)孔(4孔MTT 法、1孔掃描電鏡法),設(shè)立一空白對(duì)照組。

14、第3 代成肌細(xì)胞按2×107L-1 的濃度接種于24孔板 (1 mL/孔),2次沉淀法接種于材料。 檢測(cè)成肌細(xì)胞在靜電紡絲納米纖維膜中的黏附 能力:培養(yǎng)5 d后開始用MTT比色法測(cè)定黏附于 2172 1-8: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA +30% silk fibroin group, 80% PLA +10% silk fibroin+10% collagen group, 80% PLA +20% sil

15、k fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group, control group; PLA: poly lactic acid Figure 1 Myoblast growth curve detected by MTT 圖 1 MTT 法檢測(cè)各組成肌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 2.3 成肌細(xì)胞在纖維膜中的黏附情況 見圖2。 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 梁爽,等. 靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性 www.CRTER.org 表 1 以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各組成肌細(xì)胞的黏附率

16、Table 1 Adhesion rate of myoblasts in each group Group 1 2 3 4 5 6 7 8 x±s 0.101±0.005 0.262±0.006 0.203±0.014 0.231±0.005 0.558±0.006 0.556±0.004 0.626±0.004 0.743±0.020 _ Adhesion rate (%) 13.55 35.21 27.28 31.11 75.03 74.86 84.21 a: 1 group (1 000 kV,

17、×800) b: 2 group (1 000 kV, ×800) PLA: poly lactic acid; 1-8: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% si

18、lk fibroin + 10% collagen group, control group 70%聚乳酸+20%蠶絲蛋白+10%膠原組黏附最好。 c: 3 group (1 000 KV, ×800) d: 4 group (1 000 kV, ×800) 對(duì)其進(jìn)行方差分析,差異有顯著性意義(F=3404.599, P=0.000 < 0.05),見表2。 表 2 ANOVA 分析結(jié)果 Table 2 ANOVA analysis results Sum of squares 1.067 0.001 1.068 Mean square 0.178 0.000 Ite

19、m Between groups Within groups Total df 6 21 27 F 3 404.599 Sig. 0.000 e: 5 group (1 000 kV, ×800) f: 6 group (1 000 kV, ×800) 可以認(rèn)為成肌細(xì)胞在材料中的黏附率差異有顯著 性意義。用LSD法所分析的各組之間黏附率差異有顯著 性意義,見表3。 除80%聚乳酸+10%蠶絲蛋白+10%膠原組、 80%聚 乳酸+ 20%蠶絲蛋白組外,其余各組間黏附率差異均有 顯著性意義(P < 0.05)。 g: 7 group (1 000 kV, ×20

20、0) h: 7 group (1 000 kV, ×800) 1-7: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group

21、; PLA: poly lactic acid 表 3 各組間 LSD 分析結(jié)果 Table 3 LSD analysis results Group 1 vs. 2 1 vs. 3 1 vs. 4 1 vs. 5 1 vs. 6 1 vs. 7 2 vs. 3 2 vs. 4 2 vs. 5 2 vs. 6 2 vs. 7 Mean Significance Group difference -0.161 00 -0.102 25 -0.130 50 -0.457 00 -0.455 75 -0.525 50 0.058 75 0.030 50 -0.296 00 -0.294 75 -0.

22、364 50 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 vs. 4 3 vs. 5 3 vs. 6 3 vs. 7 4 vs. 5 4 vs. 6 4 vs. 7 5 vs. 6 5 vs. 7 6 vs. 7 Mean difference -0.028 25 -0.354 75 -0.353 50 -0.042 325 -0.326 5 -0.325 25 -0.395 00 0.001 25 -0.068 50 -0.069 75 Significance 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.809 0.000 0.000 Fig

23、ure 2 The adhesion of myoblasts on nano-fibrous membrane 圖 2 各組成肌細(xì)胞在纖維膜中的黏附情況 各組中均有成肌細(xì)胞黏附, 但以70%聚乳酸+20% 蠶絲蛋白+10%膠原組成肌細(xì)胞黏附情況為最好。 其余 6組黏附于材料上的細(xì)胞較少, 形態(tài)不規(guī)則, 為多角形, 似處于衰退期的成肌細(xì)胞。 而70%聚乳酸+20%蠶絲蛋 白+10%膠原組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,排列規(guī)律,細(xì)胞長(zhǎng)軸相 互平行,可見到成肌細(xì)胞集落形成,黏附率在 13.55%84.21%之間(以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算,見表1)。 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN:

24、ZLKHAH PLA: poly lactic acid; 1-7: pure group, 60% PLA + 30% silk fibroin + 10% collagen group, 60% PLA + 40% silk fibroin group, 70% PLA + 30% silk fibroin group, 80% PLA + 10% silk fibroin + 10% collagen group, 80% PLA + 20% silk fibroin group, 70% PLA + 20% silk fibroin + 10% collagen group 2173

25、www.CRTER.org 梁爽,等. 靜電紡絲納米纖維膜作為骨骼肌組織工程支架材料的細(xì)胞相容性 不具有細(xì)胞可進(jìn)行識(shí)別的特定位置信息,缺乏良好的細(xì) 3 討論 成肌細(xì)胞是骨骼肌中具有分化增殖潛能的干細(xì) 胞,來源于中胚層干細(xì)胞,在胚胎發(fā)育過程中由間充 質(zhì)細(xì)胞分化而成 15 胞親和性。本實(shí)驗(yàn)用70%聚乳酸、20%蠶絲蛋白、10% 膠原共混后電紡得到的纖維膜具有良好的細(xì)胞相容性, 適合作為骨骼肌組織工程的支架材料。本實(shí)驗(yàn)著重于細(xì) 胞相容性中的細(xì)胞毒性和細(xì)胞在支架材料表面的黏附和 生長(zhǎng)這兩個(gè)方面。下一步研究可以探討成肌細(xì)胞在該支 架材料中的遷移和功能,以及測(cè)定該支架材料的降解速 率,為其用于骨骼肌組織工

26、程提供更多證據(jù)。 4 參考文獻(xiàn) 1 Zeigler FC,Landeen L,Naughton GK,et al. Tissue-engineered , three-dimensional human dermis to study extracellular matrix formation in wound healing. J Toxical Cut Ocular Toxicol.1993; 12(44):303-312. Eaglstein WH, Falanga V. Tissue engineering and the development of Apligraft®

27、, a human skin equivalent. Clin Ther. 1997;19(5):894-905. Naughton G, Nansbridge J, Gentzkow G, et al. A metabolically active human dermal replacement for the treatment of diabetic foot ulcers.Artif Organs.1997;21(11):1203-1210. Cima LG,Vacanti JP,Vacanti C,et al.Tissue engineering by cell transplan

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30、. Biomaterials.1999; 20(5):419-426. Saxena AK, Marler J, Benvenuto M,et al. Skeletal muscle tissue engineering using isolated myoblasts on synthetic biodegradable polymers:preliminary studies. Tissue Eng.1999;5(5): 525-532. Saxena AK, Willital GH, Vacanti JP. Vascularized three-dimensional skeletal

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33、r cell- mediated gene therapyJ Cell Biol.1994;125(6): 1275-1287. GBT 16886.12-2005 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第12部分:樣品制備與 參照樣品 Schultz E, Mc Cormick KM. Skeletal muscle satellite cells. Rev Physiol Biochem Pharmacol.1994;123: 213-257. 。在骨骼肌中它是以肌衛(wèi)星細(xì)胞的形 式存在,位于肌纖維基底膜與肌膜之間,占1%5%。目 前較理想的提取方法是用二步消化法獲得細(xì)胞懸液后再 用差速貼壁法進(jìn)行純化。本實(shí)驗(yàn)這種方法發(fā)現(xiàn)用新生3 d 內(nèi)的乳鼠可以獲得足夠的成肌細(xì)胞,而且所獲得的成肌 細(xì)胞形態(tài)一致,極性排列。 組織工程的目的就是研制生物組織替代品并植入體 內(nèi)。替代品須滿足國(guó)際上醫(yī)療器械生物安全的相關(guān)規(guī)定, 對(duì)機(jī)體無毒害作用。 中國(guó)依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993也制定 了相應(yīng)的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),即GBT 1688614。GBT 16886將細(xì)胞毒性試驗(yàn)分成3類:浸提液 試驗(yàn)、直接接觸試驗(yàn)、間接

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