瘧疾血檢技術(shù)培訓(xùn)

1、全球基金瘧疾項(xiàng)目全球基金瘧疾項(xiàng)目鏡檢技術(shù)培訓(xùn)（二）鏡檢技術(shù)培訓(xùn)（二）戶縣疾病預(yù)防控制中心戶縣疾病預(yù)防控制中心2012年年3月月28日日瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)v采集血樣v血片制作v血片染色v瘧原蟲鏡檢采集血樣采集血樣采血部位：采血部位：耳垂耳垂或無名指，或無名指，取血方法：通常在耳垂取血，先取血方法：通常在耳垂取血，先用用75%75%酒精棉球消毒取血部位，酒精棉球消毒取血部位，待酒精干后，用左手拇指和食待酒精干后，用左手拇指和食指緊捏耳垂上方或無名指指尖，指緊捏耳垂上方或無名指指尖，右手持消毒針迅速刺入皮膚，右手持消毒針迅速刺入皮膚，不宜過深或過淺。然后用右手不宜過深或過淺。然后用右手中指

2、輕輕擠壓出血。厚血膜血中指輕輕擠壓出血。厚血膜血量約一粒米大小量約一粒米大小, ,薄血膜血量為薄血膜血量為厚血膜的一半或厚血膜的一半或1/31/3。厚血膜：用推片的一角，取血厚血膜：用推片的一角，取血一小滴（約一小滴（約44.5微升），微升），置于平置的載玻片上，由置于平置的載玻片上，由里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，涂里向外一個方向旋轉(zhuǎn)，涂成直徑成直徑0.81厘米大小圓形厘米大小圓形厚血膜。厚血膜。薄血膜：以推片一端的中部取薄血膜：以推片一端的中部取血一小滴，使血滴與載玻血一小滴，使血滴與載玻片接觸，血液沿推片邊緣片接觸，血液沿推片邊緣向兩側(cè)展開，將推片與載向兩側(cè)展開，將推片與載玻片保持玻片保持300-

3、450，均勻而迅，均勻而迅速適當(dāng)?shù)赜昧ο蚯巴瞥缮嗨龠m當(dāng)?shù)赜昧ο蚯巴瞥缮嘈伪⊙?。形薄血膜。血片制作（一）血片制作（一）厚血膜厚血膜薄血膜薄血膜血片制作（二）血片制作（二）?biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片：標(biāo)準(zhǔn)的瘧疾厚薄血膜片：v把載玻片分成六等份，把厚血膜涂在從右到左的第三格中把載玻片分成六等份，把厚血膜涂在從右到左的第三格中央，薄血膜涂在第四格前緣至第六格中部，第一、二格備央，薄血膜涂在第四格前緣至第六格中部，第一、二格備貼標(biāo)簽編號用。厚、薄血膜間用蠟筆劃線分開貼標(biāo)簽編號用。厚、薄血膜間用蠟筆劃線分開v厚血膜血量不宜過多或過少厚血膜血量不宜過多或過少v薄血膜平整薄血膜平整,無皺折和空泡無皺折和空泡.顯微

4、鏡下紅細(xì)胞單層排列顯微鏡下紅細(xì)胞單層排列血片制作（三）血片制作（三）不同血片涂布法：不同血片涂布法：v標(biāo)準(zhǔn)血片標(biāo)準(zhǔn)血片v門診發(fā)熱病人血片門診發(fā)熱病人血片v居民普查血片居民普查血片血片染色（一）血片染色（一）染色方法染色方法:v吉氏染色法吉氏染色法v瑞氏染色法瑞氏染色法 WHO推薦使用吉氏染色法推薦使用吉氏染色法血片染色（二）血片染色（二）吉氏原液的配制：吉氏原液的配制： 吉氏染粉吉氏染粉 (Azure B type) g 甘油甘油 (純純) 50ml 甲醇甲醇 (純純) 50mlv把吉氏粉置于研缽中，加少量甘油充分研磨把吉氏粉置于研缽中，加少量甘油充分研磨, 然后邊加然后邊加邊磨，直至邊磨，直

5、至50ml甘油完全加入，倒入棕色瓶中。然后甘油完全加入，倒入棕色瓶中。然后在在 研缽中加入少許甲醇清洗研缽，洗液倒入棕色瓶中，研缽中加入少許甲醇清洗研缽，洗液倒入棕色瓶中，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，再放入甲醇清洗，反復(fù)數(shù)次，直至甲醇用完。蓋好瓶蓋，充分搖勻，置于充分搖勻，置于65溫箱中溫箱中24小時，或室溫陰暗處小時，或室溫陰暗處1-2周后周后過濾，過濾，備用。備用。v整個染色液配制時間不能少于整個染色液配制時間不能少于5個小時個小時v時間越長染色效果越好。時間越長染色效果越好。血片染色（三）血片染色（三）吉氏染液的配制：吉氏染液的配制：v把吉氏原液用把吉氏原液用PH7

6、.00.2緩沖液稀釋，比緩沖液稀釋，比例約為例約為1:1520，稀釋后方可用于厚薄血，稀釋后方可用于厚薄血片染色。片染色。v吸取原液時，不要晃動瓶子吸取原液時，不要晃動瓶子,以免沉淀物泛以免沉淀物泛起影響染色效果起影響染色效果.血片染色（四）血片染色（四）v血膜固定：血膜固定：血膜充分晾干后，用甲醇固定薄血膜。厚血膜上滴加蒸餾水進(jìn)行溶血，到血膜呈灰白色時，將水倒去，晾干后再用甲醇固定。注意：薄血膜固定時，甲醇不可觸碰未溶血的厚血膜。厚血膜溶血時，蒸餾水不可觸碰薄血膜。血片染色（五）血片染色（五）v血片染色：血片染色：1.吉氏染色法：把吉氏染液滴加于已固定的厚、薄血膜上，室溫染色30分鐘，用緩沖

7、液沖洗干凈。血片晾干后鏡檢。2.快速吉氏染色法：取吉氏原液1ml，加緩沖液5ml，混勻后，滴加于厚、薄血膜上染色5分鐘，用緩沖液沖洗，晾干后鏡檢。血片染色（六）血片染色（六）3.成批血片染色：將已固定的血片插入染色缸，加入吉氏染液浸沒血片，對厚、薄血膜同時染色30分鐘。注意：如果吉氏染液是從市場上購置的成品試劑，請嚴(yán)格按照說明書操作。血片染色（七）血片染色（七）血片染色結(jié)果：血片染色結(jié)果：v染色質(zhì)量好的血片：顯微鏡下核呈紅色，胞漿呈藍(lán)色，薄血膜平整，紅細(xì)胞單層排列。v如果血片偏紅,說明染液偏酸性v如果血片偏藍(lán),說明染液偏堿性 吉氏染色血片外觀吉氏染色血片外觀血片染色（八）血片染色（八）v血片制

8、作與染色注意事項(xiàng)：血片制作與染色注意事項(xiàng)：、載玻片必須清潔無油污；、固定薄血膜時，甲醇不要觸碰到厚血膜；、厚血膜在染色之前先用清水滴加在上面進(jìn)行溶血，以防厚血膜染色后顏色發(fā)黑，影響鏡檢；、血片充分干燥后方可染色，防止沖洗染液時厚血膜脫落。5、未染色血膜的放置時間夏天不宜超過48小時，冬天不宜超過72小時，否則厚血膜會自然固定，影響鏡檢。瘧原蟲鏡檢（一） 厚血膜 薄血膜 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)血量多，面積小，原血量多，面積小，原蟲較為集中。蟲較為集中。原蟲原蟲檢出率高檢出率高血量少，面積大，干燥快紅血量少，面積大，干燥快紅細(xì)胞完整，原蟲形態(tài)極少變細(xì)胞完整，原蟲形態(tài)極少變形。用于觀察形。用于觀察原蟲形態(tài)與鑒原蟲

9、形態(tài)與鑒別蟲種。別蟲種。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)原蟲在干燥過程中皺原蟲在干燥過程中皺縮，紅細(xì)胞消失，原縮，紅細(xì)胞消失，原蟲變形較大，蟲變形較大，原蟲原蟲鑒定困難鑒定困難血量比厚血膜少許多，但面血量比厚血膜少許多，但面積是厚血膜的積是厚血膜的8-10倍。倍。檢查檢查費(fèi)時，原蟲檢出率較低費(fèi)時，原蟲檢出率較低用途用途用于瘧疾病人檢查用于瘧疾病人檢查蟲種、蟲期鑒定及初學(xué)者教蟲種、蟲期鑒定及初學(xué)者教學(xué)標(biāo)本學(xué)標(biāo)本瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)瘧原蟲厚、薄血膜鏡檢優(yōu)缺點(diǎn)顯微鏡下厚血膜讀片順序瘧原蟲鏡檢（二）v讀片順序：讀片順序：顯微鏡鏡下按由上而下、之字形順序讀片瘧原蟲鏡檢（三）鏡檢瘧原蟲結(jié)果判斷：鏡檢瘧原蟲結(jié)果判斷：v陰性

10、血片：檢查全部厚血膜視野未查見瘧原蟲；最少檢查100個厚血膜視野未查見瘧原蟲（臨床病人）。v陽性血片：檢出各期瘧原蟲（環(huán)狀體、裂殖體、配子體）。v混合感染：在一個血膜上有2種以上瘧原蟲感染稱為混合感染，較常見的是間日瘧原蟲與惡性瘧原蟲混合。v鏡檢判斷P.v+P.f混合感染：必須是看到P.v各期原蟲和P.f的配子體。間日瘧和惡性瘧的鑒定要點(diǎn)瘧原蟲鏡檢（四）瘧原蟲鏡檢（五）v瘧原蟲形態(tài)特征：間日瘧（P. vivax ） 鑒定要點(diǎn)1.紅細(xì)胞通常漲紅細(xì)胞通常漲大大 2.薛氏點(diǎn)明顯薛氏點(diǎn)明顯 3.成熟環(huán)狀體粗成熟環(huán)狀體粗大大4.滋養(yǎng)體胞漿有滋養(yǎng)體胞漿有阿米巴樣偽足阿米巴樣偽足5.血片中可見各血片中可見各

11、期的原蟲形態(tài)期的原蟲形態(tài)6.成熟裂殖體約成熟裂殖體約含含12-24個裂殖個裂殖子子 瘧原蟲鏡檢（六）v瘧原蟲形態(tài)特征：惡性瘧（P.falciparum）鑒定要點(diǎn)：1.紅細(xì)胞不漲大紅細(xì)胞不漲大2.小滋養(yǎng)體（環(huán)狀體）小滋養(yǎng)體（環(huán)狀體）纖細(xì)纖細(xì), 常有多重感染常有多重感染，環(huán)狀體，環(huán)狀體內(nèi)可有內(nèi)可有2個個核核 3.環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞環(huán)狀體可貼在紅細(xì)胞邊緣邊緣 4.血片中沒有其他發(fā)育血片中沒有其他發(fā)育期的大滋養(yǎng)體期的大滋養(yǎng)體 5.配子體呈新月形或臘配子體呈新月形或臘腸形腸形6.成熟裂殖體約含成熟裂殖體約含16-32個裂殖子個裂殖子7.可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)可出現(xiàn)茂氏點(diǎn)鏡檢示教鏡檢示教v以下血片采自現(xiàn)癥病例以下血

12、片采自現(xiàn)癥病例瘧原蟲鏡檢（七）間日瘧環(huán)狀體間日瘧環(huán)狀體2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 間日瘧滋養(yǎng)體間日瘧滋養(yǎng)體3. History of round the world safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 惡性瘧雄配子體惡性瘧雄配子體4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 三日瘧裂殖體三日瘧裂殖體5. Male recently retu

13、rned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. 白細(xì)胞白細(xì)胞6. New Australian previously from Malaysia. Intermittent temperatures and headaches. 白細(xì)胞白細(xì)胞7. Aches and pains, with fever. ? Glandular Fever, ?malaria. 間日瘧裂殖體間日瘧裂殖體惡性瘧環(huán)狀體惡性瘧環(huán)狀體18. Recent trip to Southern India- hea

14、daches and vaguely unwell. 間日瘧裂殖體間日瘧裂殖體19. Patient has been holidaying in the Dominican Republic, now feverish. 惡性瘧雄配子體惡性瘧雄配子體21. A member of the UN forces in East Timor. Presented with high temperature. 惡性瘧雌雄配子體惡性瘧雌雄配子體間日瘧裂殖體間日瘧裂殖體惡性瘧雌配子體惡性瘧雌配子體間日瘧裂殖體間日瘧裂殖體血檢質(zhì)量考核v 實(shí)驗(yàn)室條件v 血檢工作要求v 考核標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件v人員：人員：各單位

15、至少有各單位至少有1名專職或兼職的經(jīng)過瘧原蟲名專職或兼職的經(jīng)過瘧原蟲檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)的人員。熟悉瘧疾血片的制作，瘧檢驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)的人員。熟悉瘧疾血片的制作，瘧原蟲的鏡下特征，能承擔(dān)瘧疾血檢工作。原蟲的鏡下特征，能承擔(dān)瘧疾血檢工作。v環(huán)境：環(huán)境：實(shí)驗(yàn)室相對獨(dú)立，可做瘧疾血檢。實(shí)驗(yàn)室相對獨(dú)立，可做瘧疾血檢。v設(shè)備：設(shè)備：顯微鏡、玻片、玻片架、玻片合、染色缸。顯微鏡、玻片、玻片架、玻片合、染色缸。v試劑：試劑：吉氏染液、甲醇、二甲苯、鏡油。吉氏染液、甲醇、二甲苯、鏡油。血檢工作要求血檢工作要求v制定瘧原蟲鏡檢實(shí)驗(yàn)室管理制度、瘧原蟲鏡檢操作規(guī)程v對血檢對象進(jìn)行認(rèn)真登記，填寫瘧原蟲鏡檢登記表，按接樣順序編號。

16、編號：醫(yī)院名稱代碼序號。v保留鏡檢過的所有血片，以備上級抽樣復(fù)查，經(jīng)上一級機(jī)構(gòu)同意后方可清洗。陽性血片須專人管理。v血液標(biāo)本有潛在生物危害，在實(shí)驗(yàn)室血檢工作、標(biāo)本保存中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求。 縣（市縣（市/區(qū)）全球基金瘧疾項(xiàng)目發(fā)熱病人瘧原蟲血檢登記表區(qū)）全球基金瘧疾項(xiàng)目發(fā)熱病人瘧原蟲血檢登記表 血檢單位：血檢單位： 、 序序號號姓名姓名年年齡齡性性別別居住地址居住地址外出外出史及史及地點(diǎn)地點(diǎn)職職業(yè)業(yè)發(fā)發(fā)病病日日期期體體溫溫（o oC)C)臨臨床床初初診診血血檢檢日日期期血檢方法血檢方法血檢結(jié)果血檢結(jié)果檢檢驗(yàn)驗(yàn)人人簽簽名名血血樣樣編編號號鏡鏡檢檢RDRDT T陰陰性性PfPfPvPv

17、PmPmPoPo混混合合1234合合計(jì)計(jì)瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)(1)(1)項(xiàng)目項(xiàng)目檢查內(nèi)容檢查內(nèi)容質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)考核考核分值分值好好分分值值中中分分值值差差分分值值血血片片制制作作厚血膜厚血膜(25(25分）分）血量（5分）45l5略多或略少3過多或過少1位置（5分）玻片右1/3 5稍偏右4偏右過多3直徑（5分）0.81.0cm50.70.8 或1.01.2cm31.2cm1外觀(10分)圓形厚膜均勻,邊緣整齊10圓形稍不均不整齊8厚薄不勻影響著色5薄血膜薄血膜(25(25分）分）血量（5分）11.5l5略多或略少3過多或過少1位置（5分）直徑（5分）外觀(10分）玻片1/21

18、/3處5稍偏右或偏左4偏右或偏左過多32.52.0cm5稍大或稍小 3過多或過少1舌狀厚薄均勻10舌狀稍不均 5厚薄不勻呈波浪型3考核標(biāo)準(zhǔn)瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)（瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)（2）項(xiàng)目項(xiàng)目檢查檢查內(nèi)容內(nèi)容質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)考核考核分值分值好好分分值值中中分分值值差差分分值值血片染血片染色質(zhì)量色質(zhì)量(15(15分分) )外觀（5分）藍(lán)紫色5深藍(lán)色3紅色或灰白色2鏡下(10分)白細(xì)胞、瘧原蟲胞漿藍(lán)色，核紅色10染色過深，原蟲胞漿與核均呈深藍(lán)色8染色過淺，胞漿藍(lán)色不易顯見，核淡紅5血片清血片清潔度潔度(10(10分分) )外觀（5分）光潔無油灰5稍有油污2油灰粘連2鏡下（5分）無沉渣5稍有沉渣2沉渣多或有雜菌2瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)（瘧原蟲血檢考核標(biāo)準(zhǔn)（3）項(xiàng)目項(xiàng)目檢查檢查內(nèi)容內(nèi)容使用標(biāo)準(zhǔn)使用標(biāo)準(zhǔn)扣分標(biāo)準(zhǔn)扣分標(biāo)準(zhǔn)考核考