小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、小鼠骨髓的綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告0YUNNAN NORMAL UN I VER SITY本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào)姓名學(xué)院專業(yè)、班級(jí)實(shí)驗(yàn)課程名稱：教師及職稱開(kāi)課學(xué)期至學(xué)年學(xué)期填報(bào)時(shí)間年 月曰云南師范大學(xué)教務(wù)處編印一（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)序號(hào)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)時(shí)間一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握小鼠骨髓細(xì)胞染色體的制備方法。2、觀察小鼠染色體的形態(tài)特征，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的染色體數(shù)目。3、了解微核發(fā)生的機(jī)制；4、掌握微核實(shí)驗(yàn)的一般程序和實(shí)踐意義；5、掌握對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行藥物處理的一般程序；6掌握進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的一般程序和規(guī)則，并鍛煉實(shí)踐能力二、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖1、骨髓細(xì)胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中

2、期細(xì)胞而不必象 血淋巴細(xì)胞或組織那樣要經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)。經(jīng)秋水仙素處理后，分裂增殖中的骨髓細(xì)胞 由于紡績(jī)體的形成受到抑制，染色體不能正常趨向兩極而使之停留于中期，同時(shí)染色 體縮短，輪廓清晰，把收獲的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定處理，使細(xì)胞處于膨脹狀態(tài)，再將 細(xì)胞懸液滴在載片上，使細(xì)胞破裂，染色體散開(kāi)，染色后即可觀察到染色 體。2、微核(Micronucleus):染色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片，或因紡錘體受損 而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期，仍然遺留在細(xì)胞質(zhì)中。末期之后，單獨(dú)形成 一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，被包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱為微核。凡能 使染色體發(fā)生斷裂或使染色體和紡錘體聯(lián)結(jié)損傷的化學(xué)

3、物，都可用微核試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)。 各種類型的骨髓細(xì)胞都可形成微核，但有核細(xì)胞的胞質(zhì)少，微核與正常核葉及核的突 起難以鑒別。嗜多染紅細(xì)胞是分裂后期的紅細(xì)胞由幼年發(fā)展為成熟紅細(xì)胞的一個(gè)階段，此時(shí)紅細(xì) 胞的主核已排出，因胞質(zhì)內(nèi)含有核糖體，姬姆薩染色呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞的核糖體 已消失，被染成淡桔紅色。骨髓中嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量充足，微核容易辨認(rèn)，而且微核 自發(fā)率低，因此，骨髓中嗜多染紅細(xì)胞成為微核試驗(yàn)的首選細(xì)胞群。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料1、材料：小白鼠(2n=40)2、器具:注射器(1 ml，5ml各一支)、托盤(pán)、解剖剪、鑲子、吸管、離心管、 離心機(jī)、載片、濾紙、白紗布小塊等。3、 藥品：0.15mg/ml秋水仙

4、素，1%檸檬酸三鈉，固定液(3份甲醇，1份冰乙 酸，臨用時(shí)現(xiàn)配)，Giemsa染液，2.2%檸檬酸鈉，0.01 M磷酸緩沖液(PBS) pH6.8。4、生物顯微鏡、解剖剪、銀子、注射器、載玻片、蓋玻片、塑料吸瓶、吸水紙等。四、實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)、小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與觀察1、處理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射處理小鼠（注射量為0.1ml/10g體 重）。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g體重注射0.1ml o注射后24小時(shí)，可以取骨 處死：斷頸法處死小鼠。剪刀剪開(kāi)腿部的皮膚，用錫子夾住小鼠的股骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的韻面，將 吸有2

5、.2%檸檬酸三鈉溶液的小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次吹出骨髓細(xì)胞，反復(fù) 吹打直至股骨呈白色，制成細(xì)胞懸液。3、低滲：將細(xì)胞懸液在1000rpm/min離心5min,棄除上清液，留0.5ml搖勻。向細(xì)胞液中再加入1 %的檸檬酸三鈉溶液5ml用吸管輕吹打均勻，在室溫低滲30min。低滲期間，配制固定液，即甲醇：冰醋酸為3:1 （v/v），置4 ?冰箱中備用。4、預(yù)固定（1次）：低滲處理后的細(xì)胞懸液離心5分鐘，留1ml原液，搖勻。加 入新配制的固定液至6ml，吹打均勻，固定5分鐘，再在1000rpm/min離心3-5min， 去掉上清液。5、固定（2次）：沿離心管壁慢慢加入新配制的固定液6ml，用吸管

6、輕輕吹打均勻、室溫下固定5min， 1000rpm/min 3min，棄去上清；如此反復(fù)固定兩次（共固定3次）。6、根據(jù)管底細(xì)胞量的多少，加入新配制的固定液03 0.8ml，用吸管打均勻， 使其形成細(xì)胞懸液。7、滴片:將預(yù)冷的載玻片（0?冰?。?，水平或傾斜45?角放置，用吸管吸取細(xì) 胞懸液，從約0.5高處滴12滴到片子上，用口將其吹干，靜置使其干燥o8染色：將干燥的玻片放入2ml吉姆薩原液加入40ml磷酸緩沖液（pH6.8）配 成 的染液中染色20min,用磷酸緩沖液（pH6.8）沖洗，晾干后鏡檢。二、微核試驗(yàn) 方法：1、 骨髓的制取:斷頸法處死小鼠。用剪刀剪開(kāi)腿部的皮膚，用鑲子夾住小鼠的 股

7、骨，剪去股骨周圍的肌肉，將小鼠的兩股骨取出，擦凈股骨上的肌肉。去股骨的窺面，將吸有0.85% Nacl生理等滲液小注射器的針頭插入，反復(fù)幾次 吹 出骨髓細(xì)胞。反復(fù)吹打使其混合均勻，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液在1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄除上清液。2、涂片:在離心管中加入少量的小牛血清（約0.3ml）混勻后，按血常規(guī)涂片法 涂片，長(zhǎng)度約2cm -3cm （涂片時(shí)一次涂成）。在空氣中晾干。3、固定：將干燥的涂片放入甲醇液中固定5min。即使當(dāng)日不染色，也應(yīng)固定后 保存。4、染色：將固定過(guò)的涂片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色20min 30min，然后立 即用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。5、封

8、片:用濾紙及時(shí)擦干染片背面的水滴，再用雙層濾紙輕輕按壓染片，以吸 附染片上殘留的水分，再在空氣中晃動(dòng)數(shù)次，以促其盡快晾干，然后放入二甲苯中透 明5min,取出滴上適量光學(xué)樹(shù)脂膠，蓋上蓋玻片，寫(xiě)好標(biāo)簽。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率 以千分率表示。數(shù)據(jù)處理:利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS勺單因素方差分析或t檢驗(yàn)等方法，進(jìn) 行數(shù)據(jù)處 理，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如后表）。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法微核試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)總表1:受試物劑量組各受試小鼠1000個(gè)受檢細(xì)胞中含微核細(xì)胞數(shù)另 IJ mg/Kg 1 2345678 對(duì)苯二酚 120 1 38 33 35 37 34 35 36 3

9、080 2 28 31 30 32 29 28 33 2740 3 20 25 21 23 28 26 24 22秋水仙素 3 1 36 33 32 34 35 31 31 371.5 2 29 25 23 26 24 27 25 241 324 21 23 20 1925 22 19 氯化汞 3 1 2225 20 26 21 2322 18 陰性對(duì)照 3 22 2 16 22 21 19 20 18 17 1513 13 17 15 16 14 15 17 13 1 43 539 蒸Y留水陽(yáng)性對(duì)照 40mg/kg 38 44 45 40 36 41 43 39 環(huán)磷酰胺體重表2對(duì)苯二酚對(duì)動(dòng)

10、物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率組別劑量動(dòng)物數(shù)受檢細(xì)胞數(shù)含微核細(xì)胞數(shù)微核率P值（g/kg體重）（只）（個(gè)）（個(gè)）（。）受試物120 8 800080 8 8000 對(duì)苯二酚 40 8 8000溶劑對(duì)照（蒸憎水）8 8000陽(yáng)性物對(duì)照環(huán)磷酰胺（mg/kg體重）406（參考文獻(xiàn)1 孟紫強(qiáng)，阮愛(ài)東，桑楠等.SO2污染對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核的誘發(fā)作用. 環(huán)境科學(xué)，2002，23 （4） 123-125.2 孟紫強(qiáng)，桑楠，張波等二氧化硫體內(nèi)衍生物誘發(fā)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核 的效應(yīng)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20 （2） 239-243.3 耿德貴，王秀琴，劉士旺等除草劑使它隆對(duì)黃鱗細(xì)胞的致突變作用研究環(huán)境與健康雜志，2000，17 （2） 103-1