第十八章,基因組學與后基因組學

1、第十八章、基因組學 基因組：生物細胞中單套染色體的所含DNA序列的全部組成。 人類基因組：22條常染色體和X，Y染色體的DNA組成。 基因組大小 種類 Mb大腸桿菌 4.64啤酒酵母 12.1線 蟲 100果 蠅 140蝗 蟲 5000小 鼠 3300豌 豆 4800玉 米 5000小 麥 17000人 3000 分類最小基因組支原體 0.58 X 106細菌 2.8 X 106酵母 3.0 X 107霉菌 5.5 X 107蠕蟲 1.1 X 108昆蟲 0.5 X 109鳥類 0.2 X 1010兩棲類 0.1 X 1010哺乳類 2.8 X 1010 DNA序列的分類基因序列和非基因序列

2、基因序列：以起始密碼子開始，終止密碼子結束的一段DNA序列，稱為開放閱讀框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。編碼序列和非編碼序 編碼序列：編碼RNA和蛋白質的DNA序列。 非編碼序：內含子和基因的間隔序列。 單一序列和重復序列 單一序列： 基因組中只有一份的DNA序列。重復序列：基因組中重復出現(xiàn)的序列。例如，STR，SNP，微衛(wèi)星DNA等。 什么是基因？什么是基因？ 基因在哪里？基因在哪里？尋找基因的思路：基因定位基因定位基因克隆基因克隆基因分離基因分離將基因定位于染色體上將基因定位于染色體上有大到小，由粗到細，精細定位有大到小，由粗到細

3、，精細定位克隆目的基因片段克隆目的基因片段功能克隆功能克隆 克?。ㄖ虏。┗虻囊环N策略。 收集所要克隆的基因的蛋白質產物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進行定位。性狀性狀（疾?。膊。┑鞍踪|產蛋白質產物（生物物（生物學功能）學功能）從氨基酸序列從氨基酸序列出發(fā)設計出發(fā)設計DNA引物，從引物，從文庫調取基因文庫調取基因得到基得到基因序列因序列染色體定染色體定位位 分析異?；虻漠a物（蛋白質）：分析異?；虻漠a物（蛋白質）： 純化蛋白質，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩純化蛋白質，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩條不同的路線：條不同的路線：1. 進行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序進行氨

4、基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫文庫或基因組文庫中篩選對應的編碼基因；或基因組文庫中篩選對應的編碼基因；將異常蛋白質制成相應的抗體，從將異常蛋白質制成相應的抗體，從cDNA表達文庫表達文庫中篩選相應克隆。得到克隆后，就可以通過中篩選相應克隆。得到克隆后，就可以通過DNA序列分析確定導致疾病的分子缺陷。序列分析確定導致疾病的分子缺陷。 絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病如白化?。ㄈ绨谆。╝lbinism）、苯丙酮尿癥）、苯丙酮尿癥（phenylkeonuria， PKU

5、）和鐮刀形細胞貧血病）和鐮刀形細胞貧血?。╯ickle-cell disease）等，都是采取的這一策略。）等，都是采取的這一策略。血紅蛋白病血紅蛋白病鐮刀形細胞貧血癥鐮刀形細胞貧血癥正常正常HbAHbA四條多肽鏈（四條多肽鏈（2 2條條 鏈，兩條鏈，兩條 鏈）鏈） 定位克隆定位克隆又稱為“逆向遺傳學”，始于2020世紀8080年代后期利用遺傳連鎖或細胞學定位技術將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置。克?。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。疾病遺傳標記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質產物生物學功

6、能 定位克隆：通過遺傳標記定位克?。和ㄟ^遺傳標記 ，先獲得某一表型基因，先獲得某一表型基因在染色體上的定位在染色體上的定位 ，再在候選區(qū)域內選擇已知基，再在候選區(qū)域內選擇已知基因因 ，進行致病突變的篩選，進行致病突變的篩選 ，并獲得，并獲得cDNA及全基及全基因。因。基本思路是通過連鎖分析原理進行基本思路是通過連鎖分析原理進行基因定位。基因定位。若多態(tài)標記與待定基因距離較遠若多態(tài)標記與待定基因距離較遠 ，則它們在，則它們在向子代傳遞時會發(fā)生自由分離向子代傳遞時會發(fā)生自由分離 ，呈，呈“連鎖平衡連鎖平衡”；反之；反之 ，則不發(fā)生自由分離，則不發(fā)生自由分離 ，而呈現(xiàn)，而呈現(xiàn)“共分離共分離”現(xiàn)象現(xiàn)象

7、 ，即，即“連鎖不平衡連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定。據(jù)此可在染色體上定位與某一位與某一DNA標記相連鎖的基因。標記相連鎖的基因。將基因定位于染色體將基因定位于染色體 特定區(qū)段特定區(qū)段2. 候選基因篩選鑒定候選基因篩選鑒定 定位克隆的主要目的之一是將目標基因定位于特定染色體上。 主要方法：主要方法： 家系調查法家系調查法 體細胞雜交法體細胞雜交法 核酸雜交技術核酸雜交技術 等等等等A-1型短指（趾）癥法拉比（型短指（趾）癥法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學醫(yī)學院博士畢業(yè)論年在他的哈佛大學醫(yī)學院博士畢業(yè)論文中首先報道了，即世界上第一例孟德爾文中首先報道了，即世界上第一例孟德爾常染

8、色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學的常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學的經典例子被全世界的生物學和遺傳學教材經典例子被全世界的生物學和遺傳學教材廣泛引用。廣泛引用。賀林實驗室利用布依族、苗族賀林實驗室利用布依族、苗族和漢族的三個和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進行了精家系，對該病的致病基因進行了精確定位（位點定在確定位（位點定在2q35-36區(qū)）、克區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因和該基因上的三個突變位點是導致基因上的三個突變位點是導致A-1型型短指（趾）癥的直接原因。短指（趾）癥的直接原因。用遺傳標記進行基因定位 形態(tài)標記形態(tài)

9、標記 morphological markers 細胞標記細胞標記 cytological markers 生化標記 biochemical markers 分子標記分子標記 molecular markers分子遺傳標記分子遺傳標記 在核酸分子水平，對具有相對差異在核酸分子水平，對具有相對差異的等位基因的等位基因DNADNA多態(tài)性的標記，廣泛存多態(tài)性的標記，廣泛存在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又稱為稱為DNADNA分子標記，是分子標記，是DNADNA水平上遺傳水平上遺傳變異的直接反映。變異的直接反映。特點: 1. 直接以DNA形式表現(xiàn)，在生物體各發(fā)育階段,各組

10、織均可檢測到。 2.數(shù)量多，遍及整個基因組。 3.多態(tài)性高，自然界存在許多等位突變，無需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料 4. 中性，不影響目標性狀的表達，與不良性狀無必然連鎖 5. 許多分子標記表現(xiàn)為共顯性（codominance）, 能夠鑒別出純合基因型與雜 合基因型，提供完整的遺傳信息 分子遺傳標記發(fā)展 RFLP restrict fragment length polymorphism 限制性片段長度多態(tài)性 SSLP simple sequence length polymorphism 簡單序列長度多態(tài)性 SNP single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性 S

11、SLP simple sequence length polymorphism 簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性 ，又稱為VNTR variable number tandem repeat 數(shù)目可變的數(shù)目可變的串聯(lián)重復多態(tài)性串聯(lián)重復多態(tài)性 指重復單位相對較小, ,由重復單位的序列差異和數(shù)目變化, ,可形成豐富的多態(tài)性。 包括: : 小衛(wèi)星序列 minisatellite 微衛(wèi)星序列 microsatellite , 小衛(wèi)星DNA標記 minisatellite，核心序列為1160bp ，主要存在于染色體靠近端粒處，由于其拷貝數(shù)變化，在不同個體間中存在串聯(lián)數(shù)目的差異，若在重復序列兩側有限制

12、性內切酶酶切位點，則切下來的片段會呈現(xiàn)出多態(tài)性?？捎糜贒NA 指紋，DNA Finger。 微衛(wèi)星DNA標記 microsatellite，指以27個堿基為核心單位串聯(lián)重復而成的一類序列（微衛(wèi)星DNA microsatellite DNA，又稱為STR short tandem repeat 短串聯(lián)重復序列）,由于核心序列重復數(shù)目的變化而在群體中呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，但在同一家系內具有高度的遺傳保守性，以孟德爾方式遺傳。散布于整個基因組中。 SNP single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同堿基，其中最少一種在群體中的頻

13、率不小于1。 SNP分為兩種形式： 基因編碼區(qū)的SNP，稱為cSNP 遍布于基因組內的大量單堿基變異SNPSNP分析的特點：分析的特點： （1 1）SNPSNP數(shù)量大，分步密集，平均每1000bp1000bp就有一個SNPSNP （2 2）SNPSNP比STRSTR擴增更有效，不會產生假帶 （3 3）由于SNPSNP是二態(tài)的，易于自動化批量檢測，易于用計算機分析結果 SNP與RFLP和STR等DNA標記的主要不同在于： 不再以“長度”的差異作為檢測手段而是直接以序列的差異作為標記。但SNP單個基因座的多態(tài)性很差，只有二態(tài)，為此采用多個SNP基因座進行“單倍型”分析十分重要。 SNP是繼人類基因

14、組計劃之后又一國際研究競爭新熱點，該項目研究是闡明基因組功能及特點的重要基礎。SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病的重要遺傳基礎。其他遺傳標記舉例其他遺傳標記舉例AFLP amplified fragment length polymorphism 擴增片段長度多態(tài)性擴增片段長度多態(tài)性RAPD random amplified polymorphism DNA 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性SSCP single strand conformation polymorphism 單鏈構象多態(tài)性單鏈構象多態(tài)性AFLP amplified fragment length pol

15、ymorphism 擴擴增片段長度多態(tài)性增片段長度多態(tài)性 通過DNA PCR擴增基因組DNA的模板，隨后用電泳將擴增片段分離，通過DNA譜帶鑒別多態(tài)性。RAPD random amplified polymorphism DNA 隨機擴增多態(tài)性隨機擴增多態(tài)性 用于擴增多態(tài)性DNA的引物是 隨機的。在做多態(tài)性分析時，用一組引物（20 40個）在基因組全序列上掃描可獲得基因組多態(tài) 性的豐富信息。 SSCP single strand conformation polymorphism 單單鏈構象多態(tài)性鏈構象多態(tài)性 是基于PCR擴增而新發(fā)展起來的DNA多態(tài)性分析，利用PCR特異的擴增出基因組的目的D

16、NA片段，變性后形成的單鏈DNA在自然條件下能形成一定的空間構象，并且這種空間構象由DNA鏈的堿基序列決定，若堿基發(fā)生變化，將在電泳圖譜上表現(xiàn)出不同生物個體的特異性，即多態(tài)性。 用用原位雜交原位雜交 in situ hybridazation和和熒光原位雜交熒光原位雜交 fluorescence in situ hybridazation ,FISH 進行基因定位：進行基因定位： 將將DNADNA探針用同位素或熒光染料標記探針用同位素或熒光染料標記，按照堿基互補配對原則，與固定在，按照堿基互補配對原則，與固定在玻片上的中期染色體雜交后，在熒光玻片上的中期染色體雜交后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色

17、的熒光。顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色的熒光。 FISHFISH是一項十分靈敏的技術，可以是一項十分靈敏的技術，可以檢測出非整倍體，基因擴增，微小的檢測出非整倍體，基因擴增，微小的染色體重排或易位染色體重排或易位等染色體變異等染色體變異原位雜交原位雜交基因定位基因定位多色多色FISHM-FISH技術技術熒光原位雜交熒光原位雜交FISH在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關染色體變異方面的研究應用：比較基因組雜交技術 comparative genomic hybridization，CGH 利用同一種生物異常細胞的基因組做探針，與正常細胞基因組雜交，通過對雜交信號分析，發(fā)現(xiàn)不同，尋找相關基因。利用染色體步移確定基因位置定位

18、候選克隆定位候選克隆該方法是定位克隆的進一步發(fā)展將疾病相關基因定位于染色體相關區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干候選基因進一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白質功能研究疾疾病病染色體定位染色體定位若干候選若干候選基因基因確定目確定目的基因的基因蛋蛋白白質質功功能能 篩選染色體定位只是定位克隆的第一步。由于篩選、確認的困難 ，使其成為定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有: :(1)(1)對 50 0 50 0的關鍵部位進行直接測序；(2)(2)比較基因組作圖和測序； (3)(3)基因結構特征分析； (4)(4)捕獲，主要有島捕捉層析 法、外顯子捕捉法、直接篩選法等方法差異表達差異表達 原理

19、: 比較不同個體或不同細胞來源 ，即通常所指的樣本 (tester，) 和參照 (driver，) 的蛋白質或RNA兩者之間的差異 ，如缺失或特異表達部分， 從而發(fā)現(xiàn)新基因1. 差異性表達差異性表達mRNA方法方法 （1）mRNA差異顯示（差異顯示（mRNA-Differential Display，mRNA-DD） （2）抑制性消減雜交（）抑制性消減雜交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH） （3）cDNA代表性差異分析（代表性差異分析（cDNA Representational Difference Analysis，cDNA-RDA） （4

20、）cDNA microarray 2. 差異性表達蛋白質差異性表達蛋白質消減雜交消減雜交（subtractive hybrization） 利用目的基因在兩種組織或細胞中表達的差異，或者在不同發(fā)育階段、不同狀態(tài)下表達差異，通過其mRNA或單鏈cDNA進行雜交，除去兩者之間相同的基因成分，使表達有差異的基因得到充分富集。它的實質是對兩組基因轉錄本全面比較，去同存異，分離差異表達基因Subtractive cloningcDNA-RDA技術技術 cDNA-RDA（cDNA-Representative Difference Analysis）技術是）技術是1994年年Huband和和Schatz在

21、在RDA和和mRNA-DD二者基礎上二者基礎上建立的一種基因克隆新方法建立的一種基因克隆新方法 在在代表性差異分析基礎上，以代表性差異分析基礎上，以mRNA表達表達水平的差異為差減目標，因而兼有水平的差異為差減目標，因而兼有RDA和和mRNA-DD的優(yōu)點的優(yōu)點,這一方法克服了這一方法克服了mRNA-DD假陽性率高的缺點，排除與表型無關的基因，假陽性率高的缺點，排除與表型無關的基因，通過消減雜交驅逐同源序列，降低了后期鑒定通過消減雜交驅逐同源序列，降低了后期鑒定的工作量，但操作煩瑣。的工作量，但操作煩瑣。 特點：特點：腫瘤組織腫瘤組織Driver 正常組織正常組織TesterAAAAAAmRNA

22、ds cDNAMbo I 酶切酶切連接接頭連接接頭PCR擴增擴增無接頭無接頭換新接頭換新接頭雜交雜交無擴增無擴增線性擴增線性擴增指數(shù)擴增指數(shù)擴增cDNA-RDA方法簡要示意圖方法簡要示意圖因為同一種因為同一種mRNA經不同的剪接或翻經不同的剪接或翻譯后修飾加工可產生多種蛋白質，因此一譯后修飾加工可產生多種蛋白質，因此一個蛋白質組中蛋白質的數(shù)量超過相應基因個蛋白質組中蛋白質的數(shù)量超過相應基因組的基因數(shù)目。組的基因數(shù)目。蛋白質組研究常用方法：蛋白質組研究常用方法： 二維凝膠電泳技術，蛋白質序列分析，二維凝膠電泳技術，蛋白質序列分析，質譜分析等等。質譜分析等等。差異性表達蛋白質差異性表達蛋白質生物信

23、息學方法生物信息學方法通過序列的通過序列的ORFORF預測預測 建立建立cDNAcDNA文庫文庫 差減雜交得到均質化文庫差減雜交得到均質化文庫 cDNAcDNA序列測定序列測定 生物信息學分析，生物信息學分析，ORFORF預測預測 同源性比較，功能預測同源性比較，功能預測生物信息學（生物信息學（bioinformatics）是生物學，計算機科學，以及應用數(shù)學等學是生物學，計算機科學，以及應用數(shù)學等學科相互交叉而形成的一門新興學科?？葡嗷ソ徊娑纬傻囊婚T新興學科。 以計算機為主要工具，開發(fā)各種軟件，對日以計算機為主要工具，開發(fā)各種軟件，對日益增長的益增長的DNA和蛋白質的序列和結構等相和蛋白質的

24、序列和結構等相關信息進行收集、儲存、發(fā)行、提取、加工關信息進行收集、儲存、發(fā)行、提取、加工、分析和研究，同時建立理論模型，指導實、分析和研究，同時建立理論模型，指導實驗研究。驗研究。由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡和應用軟件三大部分由數(shù)據(jù)庫、計算機網(wǎng)絡和應用軟件三大部分構成，在基因組計劃中發(fā)揮不可替代的作用構成，在基因組計劃中發(fā)揮不可替代的作用 該定義包含兩方面的內容 一方面是發(fā)展強大有效的信息分析工具，構建適合于基因組研究的數(shù)據(jù)庫，用于搜索、管理、使用人類基因組和模式生物基因組的巨量信息； 另一方面是配合實驗研究，確定約30億個堿基對的人類基因組完整核苷酸順序，找出人類全部約10萬個基因在染色體上的位置以及包括基因在內的各種DNA片段的功能。 該定義包含兩方面的內容 一方面是發(fā)展強大有效的信息分析工具，構建適合于基因組研究的數(shù)據(jù)庫，用于搜索、管理、使用人類基因組和模式