第十八章,基因組學(xué)與后基因組學(xué)

1、第十八章、基因組學(xué) 基因組：生物細(xì)胞中單套染色體的所含DNA序列的全部組成。 人類基因組：22條常染色體和X，Y染色體的DNA組成。 基因組大小 種類 Mb大腸桿菌 4.64啤酒酵母 12.1線 蟲 100果 蠅 140蝗 蟲 5000小 鼠 3300豌 豆 4800玉 米 5000小 麥 17000人 3000 分類最小基因組支原體 0.58 X 106細(xì)菌 2.8 X 106酵母 3.0 X 107霉菌 5.5 X 107蠕蟲 1.1 X 108昆蟲 0.5 X 109鳥類 0.2 X 1010兩棲類 0.1 X 1010哺乳類 2.8 X 1010 DNA序列的分類基因序列和非基因序列

2、基因序列：以起始密碼子開始，終止密碼子結(jié)束的一段DNA序列，稱為開放閱讀框（open reading frame, ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。編碼序列和非編碼序 編碼序列：編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列。 非編碼序：內(nèi)含子和基因的間隔序列。 單一序列和重復(fù)序列 單一序列： 基因組中只有一份的DNA序列。重復(fù)序列：基因組中重復(fù)出現(xiàn)的序列。例如，STR，SNP，微衛(wèi)星DNA等。 什么是基因？什么是基因？ 基因在哪里？基因在哪里？尋找基因的思路：基因定位基因定位基因克隆基因克隆基因分離基因分離將基因定位于染色體上將基因定位于染色體上有大到小，由粗到細(xì)，精細(xì)定位有大到小，由粗到細(xì)

3、，精細(xì)定位克隆目的基因片段克隆目的基因片段功能克隆功能克隆 克?。ㄖ虏。┗虻囊环N策略。 收集所要克隆的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進(jìn)行定位。性狀性狀（疾病）（疾?。┑鞍踪|(zhì)產(chǎn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物（生物物（生物學(xué)功能）學(xué)功能）從氨基酸序列從氨基酸序列出發(fā)設(shè)計(jì)出發(fā)設(shè)計(jì)DNA引物，從引物，從文庫調(diào)取基因文庫調(diào)取基因得到基得到基因序列因序列染色體定染色體定位位 分析異?；虻漠a(chǎn)物（蛋白質(zhì)）：分析異?；虻漠a(chǎn)物（蛋白質(zhì)）： 純化蛋白質(zhì)，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩純化蛋白質(zhì)，弄清它是如何引起臨床癥狀的有兩條不同的路線：條不同的路線：1. 進(jìn)行氨基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序進(jìn)行氨

4、基酸序列測定，據(jù)此推測可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從列，合成寡核苷酸探針，然后用探針從cDNA文庫文庫或基因組文庫中篩選對應(yīng)的編碼基因；或基因組文庫中篩選對應(yīng)的編碼基因；將異常蛋白質(zhì)制成相應(yīng)的抗體，從將異常蛋白質(zhì)制成相應(yīng)的抗體，從cDNA表達(dá)文庫表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。得到克隆后，就可以通過中篩選相應(yīng)克隆。得到克隆后，就可以通過DNA序列分析確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。序列分析確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷。 絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病絕大部分分子病、遺傳性代謝缺陷（酶）病如白化?。ㄈ绨谆。╝lbinism）、苯丙酮尿癥）、苯丙酮尿癥（phenylkeonuria， PKU

5、）和鐮刀形細(xì)胞貧血病）和鐮刀形細(xì)胞貧血?。╯ickle-cell disease）等，都是采取的這一策略。）等，都是采取的這一策略。血紅蛋白病血紅蛋白病鐮刀形細(xì)胞貧血癥鐮刀形細(xì)胞貧血癥正常正常HbAHbA四條多肽鏈（四條多肽鏈（2 2條條 鏈，兩條鏈，兩條 鏈）鏈） 定位克隆定位克隆又稱為“逆向遺傳學(xué)”，始于2020世紀(jì)8080年代后期利用遺傳連鎖或細(xì)胞學(xué)定位技術(shù)將致病基因定位于染色體的特定區(qū)帶。定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置?？寺。簭亩ㄎ坏娜旧w區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。疾病遺傳標(biāo)記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質(zhì)產(chǎn)物生物學(xué)功

6、能 定位克?。和ㄟ^遺傳標(biāo)記定位克?。和ㄟ^遺傳標(biāo)記 ，先獲得某一表型基因，先獲得某一表型基因在染色體上的定位在染色體上的定位 ，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因因 ，進(jìn)行致病突變的篩選，進(jìn)行致病突變的篩選 ，并獲得，并獲得cDNA及全基及全基因。因?；舅悸肥峭ㄟ^連鎖分析原理進(jìn)行基本思路是通過連鎖分析原理進(jìn)行基因定位?；蚨ㄎ弧Ｈ舳鄳B(tài)標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn)若多態(tài)標(biāo)記與待定基因距離較遠(yuǎn) ，則它們在，則它們在向子代傳遞時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離向子代傳遞時(shí)會(huì)發(fā)生自由分離 ，呈，呈“連鎖平衡連鎖平衡”；反之；反之 ，則不發(fā)生自由分離，則不發(fā)生自由分離 ，而呈現(xiàn)，而呈現(xiàn)“共分離共分離”現(xiàn)象現(xiàn)象

7、 ，即，即“連鎖不平衡連鎖不平衡”。據(jù)此可在染色體上定。據(jù)此可在染色體上定位與某一位與某一DNA標(biāo)記相連鎖的基因。標(biāo)記相連鎖的基因。將基因定位于染色體將基因定位于染色體 特定區(qū)段特定區(qū)段2. 候選基因篩選鑒定候選基因篩選鑒定 定位克隆的主要目的之一是將目標(biāo)基因定位于特定染色體上。 主要方法：主要方法： 家系調(diào)查法家系調(diào)查法 體細(xì)胞雜交法體細(xì)胞雜交法 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù) 等等等等A-1型短指（趾）癥法拉比（型短指（趾）癥法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論年在他的哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士畢業(yè)論文中首先報(bào)道了，即世界上第一例孟德爾文中首先報(bào)道了，即世界上第一例孟德爾常染

8、色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的常染色體顯性遺傳病，以后作為遺傳學(xué)的經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材經(jīng)典例子被全世界的生物學(xué)和遺傳學(xué)教材廣泛引用。廣泛引用。賀林實(shí)驗(yàn)室利用布依族、苗族賀林實(shí)驗(yàn)室利用布依族、苗族和漢族的三個(gè)和漢族的三個(gè)A-1型短指（趾）癥大型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進(jìn)行了精家系，對該病的致病基因進(jìn)行了精確定位（位點(diǎn)定在確定位（位點(diǎn)定在2q35-36區(qū)）、克區(qū)）、克隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人隆，并首次發(fā)現(xiàn)了人IHH基因和該基因和該基因上的三個(gè)突變位點(diǎn)是導(dǎo)致基因上的三個(gè)突變位點(diǎn)是導(dǎo)致A-1型型短指（趾）癥的直接原因。短指（趾）癥的直接原因。用遺傳標(biāo)記進(jìn)行基因定位 形態(tài)標(biāo)記形態(tài)

9、標(biāo)記 morphological markers 細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞標(biāo)記 cytological markers 生化標(biāo)記 biochemical markers 分子標(biāo)記分子標(biāo)記 molecular markers分子遺傳標(biāo)記分子遺傳標(biāo)記 在核酸分子水平，對具有相對差異在核酸分子水平，對具有相對差異的等位基因的等位基因DNADNA多態(tài)性的標(biāo)記，廣泛存多態(tài)性的標(biāo)記，廣泛存在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又在于高等生物編碼區(qū)和非編碼區(qū)，又稱為稱為DNADNA分子標(biāo)記，是分子標(biāo)記，是DNADNA水平上遺傳水平上遺傳變異的直接反映。變異的直接反映。特點(diǎn): 1. 直接以DNA形式表現(xiàn)，在生物體各發(fā)育階段,各組

10、織均可檢測到。 2.數(shù)量多，遍及整個(gè)基因組。 3.多態(tài)性高，自然界存在許多等位突變，無需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料 4. 中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然連鎖 5. 許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性（codominance）, 能夠鑒別出純合基因型與雜 合基因型，提供完整的遺傳信息 分子遺傳標(biāo)記發(fā)展 RFLP restrict fragment length polymorphism 限制性片段長度多態(tài)性 SSLP simple sequence length polymorphism 簡單序列長度多態(tài)性 SNP single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性 S

11、SLP simple sequence length polymorphism 簡單序列長度多態(tài)性簡單序列長度多態(tài)性 ，又稱為VNTR variable number tandem repeat 數(shù)目可變的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性 指重復(fù)單位相對較小, ,由重復(fù)單位的序列差異和數(shù)目變化, ,可形成豐富的多態(tài)性。 包括: : 小衛(wèi)星序列 minisatellite 微衛(wèi)星序列 microsatellite , 小衛(wèi)星DNA標(biāo)記 minisatellite，核心序列為1160bp ，主要存在于染色體靠近端粒處，由于其拷貝數(shù)變化，在不同個(gè)體間中存在串聯(lián)數(shù)目的差異，若在重復(fù)序列兩側(cè)有限制

12、性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，則切下來的片段會(huì)呈現(xiàn)出多態(tài)性?？捎糜贒NA 指紋，DNA Finger。 微衛(wèi)星DNA標(biāo)記 microsatellite，指以27個(gè)堿基為核心單位串聯(lián)重復(fù)而成的一類序列（微衛(wèi)星DNA microsatellite DNA，又稱為STR short tandem repeat 短串聯(lián)重復(fù)序列）,由于核心序列重復(fù)數(shù)目的變化而在群體中呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，但在同一家系內(nèi)具有高度的遺傳保守性，以孟德爾方式遺傳。散布于整個(gè)基因組中。 SNP single nucleotide polymorphism 單核苷酸多態(tài)性，是指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同堿基，其中最少一種在群體中的頻

13、率不小于1。 SNP分為兩種形式： 基因編碼區(qū)的SNP，稱為cSNP 遍布于基因組內(nèi)的大量單堿基變異SNPSNP分析的特點(diǎn)：分析的特點(diǎn)： （1 1）SNPSNP數(shù)量大，分步密集，平均每1000bp1000bp就有一個(gè)SNPSNP （2 2）SNPSNP比STRSTR擴(kuò)增更有效，不會(huì)產(chǎn)生假帶 （3 3）由于SNPSNP是二態(tài)的，易于自動(dòng)化批量檢測，易于用計(jì)算機(jī)分析結(jié)果 SNP與RFLP和STR等DNA標(biāo)記的主要不同在于： 不再以“長度”的差異作為檢測手段而是直接以序列的差異作為標(biāo)記。但SNP單個(gè)基因座的多態(tài)性很差，只有二態(tài)，為此采用多個(gè)SNP基因座進(jìn)行“單倍型”分析十分重要。 SNP是繼人類基因

14、組計(jì)劃之后又一國際研究競爭新熱點(diǎn)，該項(xiàng)目研究是闡明基因組功能及特點(diǎn)的重要基礎(chǔ)。SNP是人類基因組DNA序列變異的主要形式，是決定人類疾病的重要遺傳基礎(chǔ)。其他遺傳標(biāo)記舉例其他遺傳標(biāo)記舉例AFLP amplified fragment length polymorphism 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性擴(kuò)增片段長度多態(tài)性RAPD random amplified polymorphism DNA 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性SSCP single strand conformation polymorphism 單鏈構(gòu)象多態(tài)性單鏈構(gòu)象多態(tài)性AFLP amplified fragment length pol

15、ymorphism 擴(kuò)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性增片段長度多態(tài)性 通過DNA PCR擴(kuò)增基因組DNA的模板，隨后用電泳將擴(kuò)增片段分離，通過DNA譜帶鑒別多態(tài)性。RAPD random amplified polymorphism DNA 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 用于擴(kuò)增多態(tài)性DNA的引物是 隨機(jī)的。在做多態(tài)性分析時(shí)，用一組引物（20 40個(gè)）在基因組全序列上掃描可獲得基因組多態(tài) 性的豐富信息。 SSCP single strand conformation polymorphism 單單鏈構(gòu)象多態(tài)性鏈構(gòu)象多態(tài)性 是基于PCR擴(kuò)增而新發(fā)展起來的DNA多態(tài)性分析，利用PCR特異的擴(kuò)增出基因組的目的D

16、NA片段，變性后形成的單鏈DNA在自然條件下能形成一定的空間構(gòu)象，并且這種空間構(gòu)象由DNA鏈的堿基序列決定，若堿基發(fā)生變化，將在電泳圖譜上表現(xiàn)出不同生物個(gè)體的特異性，即多態(tài)性。 用用原位雜交原位雜交 in situ hybridazation和和熒光原位雜交熒光原位雜交 fluorescence in situ hybridazation ,FISH 進(jìn)行基因定位：進(jìn)行基因定位： 將將DNADNA探針用同位素或熒光染料標(biāo)記探針用同位素或熒光染料標(biāo)記，按照堿基互補(bǔ)配對原則，與固定在，按照堿基互補(bǔ)配對原則，與固定在玻片上的中期染色體雜交后，在熒光玻片上的中期染色體雜交后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色

17、的熒光。顯微鏡下呈現(xiàn)不同顏色的熒光。 FISHFISH是一項(xiàng)十分靈敏的技術(shù)，可以是一項(xiàng)十分靈敏的技術(shù)，可以檢測出非整倍體，基因擴(kuò)增，微小的檢測出非整倍體，基因擴(kuò)增，微小的染色體重排或易位染色體重排或易位等染色體變異等染色體變異原位雜交原位雜交基因定位基因定位多色多色FISHM-FISH技術(shù)技術(shù)熒光原位雜交熒光原位雜交FISH在腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)染色體變異方面的研究應(yīng)用：比較基因組雜交技術(shù) comparative genomic hybridization，CGH 利用同一種生物異常細(xì)胞的基因組做探針，與正常細(xì)胞基因組雜交，通過對雜交信號分析，發(fā)現(xiàn)不同，尋找相關(guān)基因。利用染色體步移確定基因位置定位

18、候選克隆定位候選克隆該方法是定位克隆的進(jìn)一步發(fā)展將疾病相關(guān)基因定位于染色體相關(guān)區(qū)域該染色體區(qū)域得到若干候選基因進(jìn)一步分析得到目的cDNAcDNA蛋白質(zhì)功能研究疾疾病病染色體定位染色體定位若干候選若干候選基因基因確定目確定目的基因的基因蛋蛋白白質(zhì)質(zhì)功功能能 篩選染色體定位只是定位克隆的第一步。由于篩選、確認(rèn)的困難 ，使其成為定位克隆策略的“瓶頸”。目前獲得基因序列的方法大致有: :(1)(1)對 50 0 50 0的關(guān)鍵部位進(jìn)行直接測序；(2)(2)比較基因組作圖和測序； (3)(3)基因結(jié)構(gòu)特征分析； (4)(4)捕獲，主要有島捕捉層析 法、外顯子捕捉法、直接篩選法等方法差異表達(dá)差異表達(dá) 原理

19、: 比較不同個(gè)體或不同細(xì)胞來源 ，即通常所指的樣本 (tester，) 和參照 (driver，) 的蛋白質(zhì)或RNA兩者之間的差異 ，如缺失或特異表達(dá)部分， 從而發(fā)現(xiàn)新基因1. 差異性表達(dá)差異性表達(dá)mRNA方法方法 （1）mRNA差異顯示（差異顯示（mRNA-Differential Display，mRNA-DD） （2）抑制性消減雜交（）抑制性消減雜交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH） （3）cDNA代表性差異分析（代表性差異分析（cDNA Representational Difference Analysis，cDNA-RDA） （4

20、）cDNA microarray 2. 差異性表達(dá)蛋白質(zhì)差異性表達(dá)蛋白質(zhì)消減雜交消減雜交（subtractive hybrization） 利用目的基因在兩種組織或細(xì)胞中表達(dá)的差異，或者在不同發(fā)育階段、不同狀態(tài)下表達(dá)差異，通過其mRNA或單鏈cDNA進(jìn)行雜交，除去兩者之間相同的基因成分，使表達(dá)有差異的基因得到充分富集。它的實(shí)質(zhì)是對兩組基因轉(zhuǎn)錄本全面比較，去同存異，分離差異表達(dá)基因Subtractive cloningcDNA-RDA技術(shù)技術(shù) cDNA-RDA（cDNA-Representative Difference Analysis）技術(shù)是）技術(shù)是1994年年Huband和和Schatz在

21、在RDA和和mRNA-DD二者基礎(chǔ)上二者基礎(chǔ)上建立的一種基因克隆新方法建立的一種基因克隆新方法 在在代表性差異分析基礎(chǔ)上，以代表性差異分析基礎(chǔ)上，以mRNA表達(dá)表達(dá)水平的差異為差減目標(biāo)，因而兼有水平的差異為差減目標(biāo)，因而兼有RDA和和mRNA-DD的優(yōu)點(diǎn)的優(yōu)點(diǎn),這一方法克服了這一方法克服了mRNA-DD假陽性率高的缺點(diǎn)，排除與表型無關(guān)的基因，假陽性率高的缺點(diǎn)，排除與表型無關(guān)的基因，通過消減雜交驅(qū)逐同源序列，降低了后期鑒定通過消減雜交驅(qū)逐同源序列，降低了后期鑒定的工作量，但操作煩瑣。的工作量，但操作煩瑣。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：腫瘤組織腫瘤組織Driver 正常組織正常組織TesterAAAAAAmRNA

22、ds cDNAMbo I 酶切酶切連接接頭連接接頭PCR擴(kuò)增擴(kuò)增無接頭無接頭換新接頭換新接頭雜交雜交無擴(kuò)增無擴(kuò)增線性擴(kuò)增線性擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增指數(shù)擴(kuò)增cDNA-RDA方法簡要示意圖方法簡要示意圖因?yàn)橥环N因?yàn)橥环NmRNA經(jīng)不同的剪接或翻經(jīng)不同的剪接或翻譯后修飾加工可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，因此一譯后修飾加工可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)，因此一個(gè)蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)量超過相應(yīng)基因個(gè)蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)量超過相應(yīng)基因組的基因數(shù)目。組的基因數(shù)目。蛋白質(zhì)組研究常用方法：蛋白質(zhì)組研究常用方法： 二維凝膠電泳技術(shù)，蛋白質(zhì)序列分析，二維凝膠電泳技術(shù)，蛋白質(zhì)序列分析，質(zhì)譜分析等等。質(zhì)譜分析等等。差異性表達(dá)蛋白質(zhì)差異性表達(dá)蛋白質(zhì)生物信

23、息學(xué)方法生物信息學(xué)方法通過序列的通過序列的ORFORF預(yù)測預(yù)測 建立建立cDNAcDNA文庫文庫 差減雜交得到均質(zhì)化文庫差減雜交得到均質(zhì)化文庫 cDNAcDNA序列測定序列測定 生物信息學(xué)分析，生物信息學(xué)分析，ORFORF預(yù)測預(yù)測 同源性比較，功能預(yù)測同源性比較，功能預(yù)測生物信息學(xué)（生物信息學(xué)（bioinformatics）是生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等學(xué)是生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)，以及應(yīng)用數(shù)學(xué)等學(xué)科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。科相互交叉而形成的一門新興學(xué)科。 以計(jì)算機(jī)為主要工具，開發(fā)各種軟件，對日以計(jì)算機(jī)為主要工具，開發(fā)各種軟件，對日益增長的益增長的DNA和蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)等相和蛋白質(zhì)的

24、序列和結(jié)構(gòu)等相關(guān)信息進(jìn)行收集、儲(chǔ)存、發(fā)行、提取、加工關(guān)信息進(jìn)行收集、儲(chǔ)存、發(fā)行、提取、加工、分析和研究，同時(shí)建立理論模型，指導(dǎo)實(shí)、分析和研究，同時(shí)建立理論模型，指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)研究。驗(yàn)研究。由數(shù)據(jù)庫、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分由數(shù)據(jù)庫、計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和應(yīng)用軟件三大部分構(gòu)成，在基因組計(jì)劃中發(fā)揮不可替代的作用構(gòu)成，在基因組計(jì)劃中發(fā)揮不可替代的作用 該定義包含兩方面的內(nèi)容 一方面是發(fā)展強(qiáng)大有效的信息分析工具，構(gòu)建適合于基因組研究的數(shù)據(jù)庫，用于搜索、管理、使用人類基因組和模式生物基因組的巨量信息； 另一方面是配合實(shí)驗(yàn)研究，確定約30億個(gè)堿基對的人類基因組完整核苷酸順序，找出人類全部約10萬個(gè)基因在染色體上的位置以及包括基因在內(nèi)的各種DNA片段的功能。 該定義包含兩方面的內(nèi)容 一方面是發(fā)展強(qiáng)大有效的信息分析工具，構(gòu)建適合于基因組研究的數(shù)據(jù)庫，用于搜索、管理、使用人類基因組和模式