第五章工業(yè)微生物育種誘變劑

1、第五章第五章 工業(yè)微生物育種誘變劑工業(yè)微生物育種誘變劑 誘變劑：誘變劑：凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)自發(fā)突變率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)。遠(yuǎn)超過(guò)自發(fā)突變率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)。（1）物理誘變劑）物理誘變劑，例如，電離輻射、紫外線、電，例如，電離輻射、紫外線、電磁波等磁波等（2）化學(xué)誘變劑）化學(xué)誘變劑，如藥品、農(nóng)藥、食品添加劑、，如藥品、農(nóng)藥、食品添加劑、調(diào)味品、化妝品、洗滌劑、塑料、著色劑、調(diào)味品、化妝品、洗滌劑、塑料、著色劑、化肥、化纖等?；?、化纖等。（3）生物誘變劑）生物誘變劑，如真菌的代謝產(chǎn)物、病毒、寄，如真菌的代謝產(chǎn)物、病毒、寄生蟲(chóng)等。生蟲(chóng)

2、等。 生物體內(nèi)還有一些生物體內(nèi)還有一些內(nèi)源性內(nèi)源性誘變劑。內(nèi)源性誘變劑是誘變劑。內(nèi)源性誘變劑是在人體健康異常的情況下產(chǎn)生的，如遺傳因素、內(nèi)在人體健康異常的情況下產(chǎn)生的，如遺傳因素、內(nèi)分泌紊亂等。分泌紊亂等。 第一節(jié)第一節(jié) 物理誘變劑物理誘變劑 物理誘變劑是指通常使用的物理輻射中的各種射線。物理誘變劑是指通常使用的物理輻射中的各種射線。 射線包括：射線包括：紫外線、紫外線、X射線、射線、射線、快中子、射線、快中子、射射線、線、射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇射線、微波、超聲波、電磁波、激光射線和宇宙線等。宙線等。 物理輻射物理輻射分為分為電離輻射電離輻射和和非電離輻射非電離輻射，都是以量

3、，都是以量子為單位的可以發(fā)射能量的射線。子為單位的可以發(fā)射能量的射線。 電離輻射：電離輻射：X射線射線和和射線射線、快中子快中子 非電離輻射：非電離輻射：紫外線紫外線射線的種類射線的種類室外活體輻照圃室內(nèi)輻照源輻射離我們有多遠(yuǎn)輻射離我們有多遠(yuǎn) 在我們的生活環(huán)境中，輻射無(wú)處不在！在我們的生活環(huán)境中，輻射無(wú)處不在！ 家用電器：家用電器：微波爐、吸塵器、電視、電冰箱、空調(diào)等；微波爐、吸塵器、電視、電冰箱、空調(diào)等；辦公設(shè)備：辦公設(shè)備：手機(jī)、電腦、復(fù)印機(jī)、電子儀器、醫(yī)療設(shè)備等手機(jī)、電腦、復(fù)印機(jī)、電子儀器、醫(yī)療設(shè)備等 家庭裝飾家庭裝飾：大理石大理石、復(fù)合地板、墻壁紙、涂料等、復(fù)合地板、墻壁紙、涂料等 周邊

4、環(huán)境：周邊環(huán)境：高壓線、變電站、電視（廣播）信號(hào)發(fā)射塔等高壓線、變電站、電視（廣播）信號(hào)發(fā)射塔等 自然環(huán)境：自然環(huán)境：太陽(yáng)黑子等太陽(yáng)黑子等 一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng)一、物理誘變劑的生物學(xué)效應(yīng) 物理誘變劑對(duì)微生物的誘變作用主要是由高物理誘變劑對(duì)微生物的誘變作用主要是由高能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的能輻射導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異的一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過(guò)程。分為一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)過(guò)程。分為物理、物理物理、物理化學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)化學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)等幾個(gè)階段。等幾個(gè)階段。電離輻射主要引起電離輻射主要引起DNA上的基因突變和染色上的基因突變和染色體的畸變。體的畸變。非電離輻射主

5、要導(dǎo)致形成非電離輻射主要導(dǎo)致形成嘧啶二聚體嘧啶二聚體。 二、輻射引起生物效應(yīng)的因素二、輻射引起生物效應(yīng)的因素 輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱既決定于微生物內(nèi)輻射引起生物學(xué)效應(yīng)的強(qiáng)弱既決定于微生物內(nèi)在遺傳因素，也受外界環(huán)境條件的影響。在遺傳因素，也受外界環(huán)境條件的影響。 1.微生物的遺傳背景微生物的遺傳背景2.微生物的生理狀態(tài)微生物的生理狀態(tài)3.可見(jiàn)光可見(jiàn)光4.水分水分5.溫度溫度6.空氣或氧氣空氣或氧氣三、非電離輻射三、非電離輻射紫外線紫外線 紫外線是紫外線是電磁波譜電磁波譜中波長(zhǎng)從中波長(zhǎng)從0.010.40微米微米輻射輻射的總稱，不能引起人們的視覺(jué)。電磁譜中波長(zhǎng)的總稱，不能引起人們的視覺(jué)。電磁譜中波

6、長(zhǎng)0.01 0.04微米輻射，既微米輻射，既可見(jiàn)光可見(jiàn)光紫端到紫端到X射線射線間的輻射。間的輻射。1801年德國(guó)物理學(xué)家年德國(guó)物理學(xué)家里特里特發(fā)現(xiàn)在日光光譜的紫發(fā)現(xiàn)在日光光譜的紫端外側(cè)一段能夠使含有溴化銀的照相底片感光，因而端外側(cè)一段能夠使含有溴化銀的照相底片感光，因而發(fā)現(xiàn)了紫外線的存在。發(fā)現(xiàn)了紫外線的存在。自然界的主要紫外線自然界的主要紫外線光源光源是是太陽(yáng)太陽(yáng)。太陽(yáng)光透過(guò)大氣。太陽(yáng)光透過(guò)大氣層時(shí)波長(zhǎng)短于層時(shí)波長(zhǎng)短于29010-9米的紫外線為米的紫外線為大氣層大氣層中的中的臭臭氧氧吸收掉。人工的紫外線光源有多種氣體的吸收掉。人工的紫外線光源有多種氣體的電弧電弧(如如低壓汞弧、高壓汞弧低壓汞弧

7、、高壓汞弧)，紫外線有化學(xué)作用能使照相，紫外線有化學(xué)作用能使照相底片感光，熒光作用強(qiáng)，底片感光，熒光作用強(qiáng)，日光燈日光燈、各種、各種熒光燈熒光燈和農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)上用來(lái)誘殺害蟲(chóng)的上用來(lái)誘殺害蟲(chóng)的黑光燈黑光燈都是用紫外線激發(fā)熒光物質(zhì)都是用紫外線激發(fā)熒光物質(zhì)發(fā)光的。紫外線還可以防偽。紫外線還有生理作用，發(fā)光的。紫外線還可以防偽。紫外線還有生理作用，能殺菌、消毒、治療能殺菌、消毒、治療皮膚病皮膚病和和軟骨病軟骨病等。紫外線的粒等。紫外線的粒子性較強(qiáng)，能使各種金屬產(chǎn)生子性較強(qiáng)，能使各種金屬產(chǎn)生光電效應(yīng)光電效應(yīng)。 紫外線強(qiáng)烈作用于皮膚時(shí)，可發(fā)生光照性紫外線強(qiáng)烈作用于皮膚時(shí)，可發(fā)生光照性皮炎皮炎，皮膚上出現(xiàn)皮膚

8、上出現(xiàn)紅斑、癢、水皰、水腫紅斑、癢、水皰、水腫等；嚴(yán)重的還可引等；嚴(yán)重的還可引起皮膚癌。起皮膚癌。紫外線作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可出現(xiàn)頭痛、頭暈、紫外線作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可出現(xiàn)頭痛、頭暈、體溫升高等。作用于眼部，可引起體溫升高等。作用于眼部，可引起結(jié)膜炎結(jié)膜炎、角膜炎角膜炎，稱為光照性眼炎，還有可能誘發(fā)稱為光照性眼炎，還有可能誘發(fā)白內(nèi)障白內(nèi)障，在焊接過(guò)程，在焊接過(guò)程中產(chǎn)生的紫外線會(huì)使中產(chǎn)生的紫外線會(huì)使焊工焊工患上患上電光性眼炎電光性眼炎。 目前，國(guó)內(nèi)外的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)紡織品的防紫外線性能一目前，國(guó)內(nèi)外的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)紡織品的防紫外線性能一般都使用般都使用UPF值值，即紫外線防護(hù)系數(shù)值進(jìn)行評(píng)定。，即紫外線防護(hù)系數(shù)

9、值進(jìn)行評(píng)定。1.UPF值值是紫外線對(duì)未防護(hù)的皮膚的平均輻射量的比是紫外線對(duì)未防護(hù)的皮膚的平均輻射量的比值，值，UPFUPF值越大，表明防紫外線性能越好。值越大，表明防紫外線性能越好。2.2.只有當(dāng)只有當(dāng)UPFUPF3030時(shí)，并且時(shí)，并且UVAUVA的透過(guò)率小于的透過(guò)率小于5 5時(shí)，才時(shí)，才能稱為防紫外線產(chǎn)品，防護(hù)等級(jí)標(biāo)識(shí)為能稱為防紫外線產(chǎn)品，防護(hù)等級(jí)標(biāo)識(shí)為UPF30UPF30；3.3.而當(dāng)而當(dāng)UPFUPF5050時(shí)，則表明該產(chǎn)品的紫外線防護(hù)性能極時(shí)，則表明該產(chǎn)品的紫外線防護(hù)性能極佳，防護(hù)等級(jí)標(biāo)識(shí)為佳，防護(hù)等級(jí)標(biāo)識(shí)為UPF50UPF50。 UPF范圍范圍防護(hù)分類防護(hù)分類紫外線透過(guò)率（）紫外線透

10、過(guò)率（）UPF標(biāo)識(shí)標(biāo)識(shí)1524較好防護(hù)較好防護(hù)6.74.215，202539非常好的防護(hù)非常好的防護(hù)4.12.625，30，354050，50非常優(yōu)異的防護(hù)非常優(yōu)異的防護(hù) 2.540，45，50，50（一）紫外線的誘變機(jī)制和（一）紫外線的誘變機(jī)制和DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù)1. 紫外線的誘變機(jī)制紫外線的誘變機(jī)制 紫外線引起：紫外線引起：u DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)；與蛋白質(zhì)的交聯(lián)；u 胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用；胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用；u DNA鏈的斷裂；鏈的斷裂；u 嘧啶二聚體嘧啶二聚體的形成（單鏈上相鄰兩個(gè)胸腺嘧啶之的形成（單鏈上相鄰兩個(gè)胸腺嘧啶之間或雙鏈相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)胸腺嘧啶之間）。間或雙

11、鏈相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)胸腺嘧啶之間）。 紫外線可使空氣中的紫外線可使空氣中的2分子變成分子變成3臭氧易分解放臭氧易分解放出原子氧出原子氧強(qiáng)殺菌作用。強(qiáng)殺菌作用。 2 紫外線紫外線 O3 O2O 2. DNA損傷修復(fù)損傷修復(fù) 包括光修復(fù)、切補(bǔ)修復(fù)、重組修復(fù)、包括光修復(fù)、切補(bǔ)修復(fù)、重組修復(fù)、SOS修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)系統(tǒng)及聚合酶的校正作用。及聚合酶的校正作用。（1）光復(fù)活）光復(fù)活 一般微生物中都存在光復(fù)活作用，紫外線誘變時(shí)，一般微生物中都存在光復(fù)活作用，紫外線誘變時(shí)，照照射或分離均應(yīng)在紅光下進(jìn)行。射或分離均應(yīng)在紅光下進(jìn)行。（2）切補(bǔ)修復(fù)）切補(bǔ)修復(fù) 在實(shí)際誘變工作中要采取某些措施避免暗修復(fù)，如在實(shí)際誘變工作中要采取

12、某些措施避免暗修復(fù)，如加入某些物質(zhì)，提高突變頻率。加入某些物質(zhì)，提高突變頻率。 （二）紫外線誘變（二）紫外線誘變 1. 紫外線的有效光譜紫外線的有效光譜 最有效波長(zhǎng)為最有效波長(zhǎng)為253.7 nm（2537 ），），即即260 nm的紫外的紫外線。線。 30W紫外燈光譜分布范圍廣，誘變效率差，紫外燈光譜分布范圍廣，誘變效率差，15W紫外紫外燈燈80%波長(zhǎng)幾種在波長(zhǎng)幾種在2537 ，誘變效果比誘變效果比30W30W的好。的好。2. 紫外線的輻射劑量紫外線的輻射劑量 絕對(duì)劑量單位：絕對(duì)劑量單位：erg/mm2 相對(duì)劑量單位：用照射時(shí)間或殺菌率表示。一般認(rèn)為殺相對(duì)劑量單位：用照射時(shí)間或殺菌率表示。一般

13、認(rèn)為殺菌率在菌率在90%99.9%時(shí)，誘變效果較好。時(shí)，誘變效果較好。移動(dòng)式紫外燈移動(dòng)式紫外燈 15W紫外燈紫外燈不同微生物所需殺菌時(shí)間不同微生物所需殺菌時(shí)間15W功率的紫外燈管和固定距離為功率的紫外燈管和固定距離為30cm的條件下的條件下照射微生物，要使殺菌率達(dá)到照射微生物，要使殺菌率達(dá)到9099.9的效果：的效果：芽孢菌約需芽孢菌約需10 min；照射短小芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)體來(lái)獲得缺陷型需要照射短小芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)體來(lái)獲得缺陷型需要13 min；一般微生物營(yíng)養(yǎng)體照射一般微生物營(yíng)養(yǎng)體照射35min；無(wú)芽孢菌和革蘭氏陽(yáng)性菌只需無(wú)芽孢菌和革蘭氏陽(yáng)性菌只需0.52 min。 紫外線誘變的步驟與方法：紫外

14、線誘變的步驟與方法： （1 1）出發(fā)菌株，）出發(fā)菌株，把細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)把細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。到孢子剛成熟。（2）前培養(yǎng)，）前培養(yǎng)，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時(shí)加入抑制修復(fù)的物質(zhì)（咖營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時(shí)加入抑制修復(fù)的物質(zhì)（咖啡堿或異煙肼），達(dá)到最佳生理狀態(tài)。啡堿或異煙肼），達(dá)到最佳生理狀態(tài)。（3）制備菌懸液；）制備菌懸液；（4）紫外線照射，紫外線照射，暗室進(jìn)行，或誘變后立即浸入冰水中暗室進(jìn)行，或誘變后立即浸入冰水中12 h，低溫抑制突變修復(fù)。低溫抑制突變修復(fù)。（5）后培養(yǎng)，）后培養(yǎng)，根據(jù)延遲現(xiàn)象的原理，照射完畢的菌懸液加入到適根據(jù)延遲現(xiàn)象的

15、原理，照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體繁殖的培養(yǎng)基，在適宜溫度下培養(yǎng)合于正突變體繁殖的培養(yǎng)基，在適宜溫度下培養(yǎng)1.52 h。（6）稀釋涂皿，稀釋涂皿，后培養(yǎng)結(jié)束后，從中取一定量培養(yǎng)物，作不同稀后培養(yǎng)結(jié)束后，從中取一定量培養(yǎng)物，作不同稀釋度，涂皿，并且以未經(jīng)紫外線照射過(guò)的菌懸液作對(duì)照，培釋度，涂皿，并且以未經(jīng)紫外線照射過(guò)的菌懸液作對(duì)照，培養(yǎng)后，挑取菌落，以待篩選。養(yǎng)后，挑取菌落，以待篩選。四、電離輻射四、電離輻射倫琴和倫琴和X射線射線河南杞縣河南杞縣“杞人憂鈷杞人憂鈷”四川成都放四川成都放60CO運(yùn)輸運(yùn)輸2. 電離輻射劑量電離輻射劑量 快中子：快中子：拉德（拉德（rad）；）；倫琴（倫琴（R

16、） 致死率達(dá)到致死率達(dá)到5085比較合適，誘變劑量大約在比較合適，誘變劑量大約在1530krad(千拉德千拉德)。 X射線和射線和射線：倫琴（射線：倫琴（R） 倫琴：倫琴：1cm3干燥空氣在干燥空氣在0，1.103105Pa（760mmHg氣壓下）產(chǎn)生氣壓下）產(chǎn)生2.08109離子時(shí)所需的離子時(shí)所需的能量。能量。 達(dá)到達(dá)到1/1000的菌體生存率，劑量大約在的菌體生存率，劑量大約在1萬(wàn)萬(wàn)20萬(wàn)萬(wàn)R。 3. 電離輻射的照射方法電離輻射的照射方法直接對(duì)平皿上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行照射；直接對(duì)平皿上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行照射；菌懸液置于試管內(nèi)并浸入冰水中照射。菌懸液置于試管內(nèi)并浸入冰水中照射。 處理完畢后繼續(xù)冰浴可

17、降低或抑制修復(fù)酶的活性。處理完畢后繼續(xù)冰浴可降低或抑制修復(fù)酶的活性。 宇宙射線宇宙射線五、近年來(lái)發(fā)展的新型誘變劑五、近年來(lái)發(fā)展的新型誘變劑 1. 微波微波 微波對(duì)微生物的誘變效應(yīng)有微波對(duì)微生物的誘變效應(yīng)有2個(gè)方面的因素，即個(gè)方面的因素，即熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。 熱效應(yīng)熱效應(yīng)是指物料吸收微波能量，使溫度升高從而是指物料吸收微波能量，使溫度升高從而達(dá)到滅菌的效果；達(dá)到滅菌的效果； 非熱效應(yīng)非熱效應(yīng)則是在電磁波的作用下，生物體內(nèi)不產(chǎn)則是在電磁波的作用下，生物體內(nèi)不產(chǎn)生明顯的升溫，卻可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物效應(yīng)。生明顯的升溫，卻可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物效應(yīng)。2. 紅外射線紅外射線 紅外輻射能促進(jìn)菌體

18、代謝，提高對(duì)紫外損傷的抗性。紅外輻射能促進(jìn)菌體代謝，提高對(duì)紫外損傷的抗性。在紫外線中增加紅外輻射可顯著提高誘變效果。在紫外線中增加紅外輻射可顯著提高誘變效果。3. 激光激光 又稱光微粒?？梢鹩址Q光微粒?？梢餌NA、染色體畸變效應(yīng)，酶的激染色體畸變效應(yīng)，酶的激活和鈍化以及細(xì)胞的分裂和細(xì)胞代謝活動(dòng)的改變等?；詈外g化以及細(xì)胞的分裂和細(xì)胞代謝活動(dòng)的改變等。4. 高能電子流高能電子流 原生質(zhì)體誘變?cè)|(zhì)體誘變u 當(dāng)當(dāng)真空真空中有一束離子束射向一塊固體材料時(shí)，離子束把中有一束離子束射向一塊固體材料時(shí)，離子束把固體材料的原子或分子撞出固體材料表面，這個(gè)現(xiàn)象叫固體材料的原子或分子撞出固體材料表面，這個(gè)現(xiàn)象

19、叫做做濺射濺射；u而當(dāng)離子束射到固體材料時(shí)，從固體材料表面彈了回來(lái)，而當(dāng)離子束射到固體材料時(shí)，從固體材料表面彈了回來(lái)，或者穿出固體材料而去，這些現(xiàn)象叫做或者穿出固體材料而去，這些現(xiàn)象叫做散射散射；u另外有一種現(xiàn)象是，離子束射到固體材料以后，受到固另外有一種現(xiàn)象是，離子束射到固體材料以后，受到固體材料的抵抗而速度慢慢減低下來(lái)，并最終停留在固體體材料的抵抗而速度慢慢減低下來(lái)，并最終停留在固體材料中，這一現(xiàn)象就叫做材料中，這一現(xiàn)象就叫做離子注入離子注入。 在半導(dǎo)體材料摻雜，金屬、陶瓷、在半導(dǎo)體材料摻雜，金屬、陶瓷、高分子聚合物高分子聚合物等等的表面改性上獲得了極為廣泛的應(yīng)用，的表面改性上獲得了極為廣

20、泛的應(yīng)用， 5. 離子注入離子注入 離子注入誘變，就是利用離子注入生物體引起遺傳物離子注入誘變，就是利用離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致性狀的變異，從而達(dá)到育種的目的。離子質(zhì)的改變，導(dǎo)致性狀的變異，從而達(dá)到育種的目的。離子注入誘變的優(yōu)點(diǎn)：注入誘變的優(yōu)點(diǎn)：（1）離子束與生物體作用離子束與生物體作用，不僅有能量沉積，同時(shí)有質(zhì)，不僅有能量沉積，同時(shí)有質(zhì)量沉積。量沉積。（2）由于注入離子的由于注入離子的不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量、劑量的組合的組合，可提供眾多的誘變條件。變異幅度大。，可提供眾多的誘變條件。變異幅度大。（3）離子注入具有作用離子注入具有作用區(qū)域的選擇性、

21、種類的多樣性區(qū)域的選擇性、種類的多樣性，其作用是局部的、可控制的、可對(duì)生物體進(jìn)行定點(diǎn)區(qū)域的其作用是局部的、可控制的、可對(duì)生物體進(jìn)行定點(diǎn)區(qū)域的誘變。誘變。 第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑 化學(xué)誘變劑：化學(xué)誘變劑：是一類能對(duì)是一類能對(duì)DNA起作用、改變起結(jié)起作用、改變起結(jié)構(gòu)、并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。構(gòu)、并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)。 包括：包括：堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑以及其以及其他種類等。他種類等。 化學(xué)突變劑具有化學(xué)突變劑具有專一性專一性，只對(duì)基因的某部位發(fā)生，只對(duì)基因的某部位發(fā)生作用。作用。 化學(xué)誘變劑的劑量主要決定于其化學(xué)誘變劑的劑量主要決定于其濃度濃

22、度和和處理時(shí)間處理時(shí)間。 劑量使用原則：劑量使用原則：以誘變效應(yīng)大，而副反應(yīng)小為原則。以誘變效應(yīng)大，而副反應(yīng)小為原則。 注意：注意：90以上的化學(xué)誘變劑以上的化學(xué)誘變劑都是都是致癌物質(zhì)或極毒致癌物質(zhì)或極毒藥品藥品。使用時(shí)注意自身安全，并防止污染環(huán)境。使用時(shí)注意自身安全，并防止污染環(huán)境。 一、堿基類似物一、堿基類似物 堿基類似物：堿基類似物：是一類和天然的嘌呤嘧啶等四種是一類和天然的嘌呤嘧啶等四種堿基分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。既能誘發(fā)正向突變，又堿基分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)。既能誘發(fā)正向突變，又能誘發(fā)回復(fù)突變。能誘發(fā)回復(fù)突變。 5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU）、）、5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-FU）、）、

23、5-脫溴尿嘧啶（脫溴尿嘧啶（BUdr）、）、5-碘尿嘧啶（碘尿嘧啶（5-IU）、2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP）、）、6-巰基嘌呤（巰基嘌呤（6-MP） 常用常用5-BU和和AP。 堿基類似物的誘變作用是取代核酸分子中堿基的堿基類似物的誘變作用是取代核酸分子中堿基的位置，再通過(guò)位置，再通過(guò)DNADNA的復(fù)制，引起突變，因此也叫的復(fù)制，引起突變，因此也叫“摻摻入誘變劑入誘變劑”，在微生物細(xì)胞處在代謝的旺盛期效果最在微生物細(xì)胞處在代謝的旺盛期效果最佳。佳。 同分異構(gòu)現(xiàn)同分異構(gòu)現(xiàn)象，嘧啶分子象，嘧啶分子以酮式和烯醇以酮式和烯醇式形式出現(xiàn)；式形式出現(xiàn)；嘌呤分子以胺嘌呤分子以胺基和亞胺基互基和亞胺基互為變

24、構(gòu)。為變構(gòu)。 （一）堿基類似物的誘變機(jī)制（一）堿基類似物的誘變機(jī)制 正常摻入錯(cuò)誤復(fù)制正常摻入錯(cuò)誤復(fù)制錯(cuò)誤摻入正常復(fù)制錯(cuò)誤摻入正常復(fù)制 堿基類似物的誘變堿基類似物的誘變可回復(fù)突變?？苫貜?fù)突變。 復(fù)制期：復(fù)制期：細(xì)菌采用細(xì)菌采用對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，霉菌、放線菌的細(xì)胞，霉菌、放線菌采用采用孢子孢子，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動(dòng)狀態(tài)，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動(dòng)狀態(tài)，并要加大并要加大5-BU的濃度，處理過(guò)程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。的濃度，處理過(guò)程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。 2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（AP）可以和胸腺嘧啶互配，但出可以和胸腺嘧啶互配，但出現(xiàn)亞氨基狀態(tài)時(shí)，和胞嘧啶配對(duì)?，F(xiàn)亞氨基狀態(tài)時(shí)，和胞嘧啶配對(duì)。（二）

25、堿基類似物的誘變處理方法（以（二）堿基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）為例） 5-BU和和5-FU為白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。為白色結(jié)晶粉末，能溶于水或乙醇。1. 單獨(dú)處理單獨(dú)處理 斜面斜面前培養(yǎng)液體培養(yǎng)基（對(duì)數(shù)期）前培養(yǎng)液體培養(yǎng)基（對(duì)數(shù)期）離心去除培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)液，加入生理鹽水或緩沖液，饑餓培養(yǎng)加入生理鹽水或緩沖液，饑餓培養(yǎng)810 h 將將5-BU或或5-FU加入培養(yǎng)液，濃度為加入培養(yǎng)液，濃度為2540g/ml 取取0.10.2ml涂平板培養(yǎng)涂平板培養(yǎng) 挑單菌落挑單菌落 真菌、放線菌孢子需加真菌、放線菌孢子需加0.11m mg/ml的的5-FU 振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)612h。2.

26、 與輻射線復(fù)合處理與輻射線復(fù)合處理 聯(lián)合處理，提高突變率。聯(lián)合處理，提高突變率。 二、烷化劑二、烷化劑 活性烷基易取代活性烷基易取代DNA分子中活潑的氫原子，從而分子中活潑的氫原子，從而改變改變DNA分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)，引起突變。，引起突變。單功能烷化劑：?jiǎn)喂δ芡榛瘎簩?duì)生物毒性小，誘變效應(yīng)大。對(duì)生物毒性小，誘變效應(yīng)大。雙功能烷化劑：雙功能烷化劑：兩個(gè)烷化基團(tuán)特異地與兩個(gè)烷化基團(tuán)特異地與DNA鳥(niǎo)嘌鳥(niǎo)嘌呤起反應(yīng)，很容易在呤起反應(yīng)，很容易在相對(duì)相對(duì)DNA鏈間形成共價(jià)鏈鏈間形成共價(jià)鏈而產(chǎn)生而產(chǎn)生交聯(lián)現(xiàn)象，妨礙雙鏈分開(kāi)及交聯(lián)現(xiàn)象，妨礙雙鏈分開(kāi)及DNA的復(fù)制，導(dǎo)致生物死的復(fù)制，導(dǎo)致生物死亡。亡。綜合衡量，

27、綜合衡量，乙基功能基乙基功能基誘變效應(yīng)比誘變效應(yīng)比甲基功能甲基功能基要基要強(qiáng)，強(qiáng)，雙功能基雙功能基和和多功能基多功能基烷化劑比單功能基反應(yīng)速度烷化劑比單功能基反應(yīng)速度快，如硫芥、氮芥等?？?，如硫芥、氮芥等。 （一）烷化劑的作用機(jī)制（一）烷化劑的作用機(jī)制 主要通過(guò)烷化基團(tuán)使主要通過(guò)烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸分子上的堿基及磷酸部分被烷化，部分被烷化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)失誤而引起復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)失誤而引起突變。突變。 突變的主要位點(diǎn)：突變的主要位點(diǎn)：鳥(niǎo)嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤的N7，鳥(niǎo)嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤的O6、胸腺嘧啶胸腺嘧啶O4 突變的次要位點(diǎn)：突變的次要位點(diǎn)：鳥(niǎo)嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤的N3，腺嘌呤的腺嘌呤的

28、N2、腺嘌呤的腺嘌呤的N7、胞嘧啶胞嘧啶N3 （二）烷化劑的性質(zhì)（二）烷化劑的性質(zhì)溶液烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶溶液烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生分解。液中容易發(fā)生分解。大部分半衰期很短，其長(zhǎng)短與溫度、溶液大部分半衰期很短，其長(zhǎng)短與溫度、溶液pH關(guān)系關(guān)系很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配還要避光。很大。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配還要避光。配制烷化劑時(shí)，要采用合適的出緩沖液。配制烷化劑時(shí)，要采用合適的出緩沖液。 有毒！有毒！ 超級(jí)誘變劑超級(jí)誘變劑之稱，適合誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，之稱，適合誘發(fā)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，還能使多基因并發(fā)突變。還能使多基因并發(fā)突變。 NTG在水溶

29、液中隨不同在水溶液中隨不同pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物。通常在物。通常在pH 6.0的條件下進(jìn)行誘變處理，常用磷的條件下進(jìn)行誘變處理，常用磷酸緩沖液和酸緩沖液和Tris緩沖液。緩沖液。 1. 1-甲基甲基-3-硝基硝基-1-亞硝基胍（亞硝基胍（NTG或或NG或或MNNG）NTG誘變處理方法：誘變處理方法：步驟：步驟： 新鮮斜面制備菌懸液；新鮮斜面制備菌懸液； 配制配制NTG母液；母液； 菌懸液和菌懸液和NTG溶液混合保溫處理；溶液混合保溫處理； 以冷的生理鹽水稀釋洗滌菌體終止反應(yīng)。以冷的生理鹽水稀釋洗滌菌體終止反應(yīng)。 平皿分離。平皿分離。其他方法：其他方法：液體培養(yǎng)后直接加入液體

30、培養(yǎng)后直接加入NTG；NTG與瓊脂與瓊脂和菌液混合制平板。和菌液混合制平板。 注意：注意： NTG是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手是一種強(qiáng)烈致癌物質(zhì)，操作時(shí)要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過(guò)櫥中進(jìn)行。凡接觸過(guò)NTG的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處的器皿必須及時(shí)、單獨(dú)處理，例用自來(lái)水大量沖洗或用理，例用自來(lái)水大量沖洗或用1-2N的的NaOH浸泡過(guò)浸泡過(guò)夜，洗凈。夜，洗凈。2. 甲基磺酸乙酯（乙基硫酸甲烷，甲基磺酸乙酯（乙基硫酸甲烷，EMS） EMS誘變處理方法：誘變處理方法： EMS母液配制；母液配制；菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)

31、期，制成菌菌體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，制成菌懸液；懸液；兩者混合保溫處理；兩者混合保溫處理；以冷的生理鹽水稀以冷的生理鹽水稀釋洗滌菌體終止反應(yīng)。釋洗滌菌體終止反應(yīng)。平皿分離。平皿分離。 EMS是劇毒的誘變劑，在整個(gè)誘變過(guò)程，包括配是劇毒的誘變劑，在整個(gè)誘變過(guò)程，包括配制藥品、操作處理、保存等都要嚴(yán)守安全，不能接制藥品、操作處理、保存等都要嚴(yán)守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過(guò)觸皮膚，所有接觸過(guò)EMS的器皿，單獨(dú)用大量水沖的器皿，單獨(dú)用大量水沖洗洗滌，或用洗洗滌，或用10NaS2O3溶液浸泡過(guò)夜，再用清溶液浸泡過(guò)夜，再用清水沖洗干凈。水沖洗干凈。 3. 硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DES） DES原液用乙醇助溶，

32、磷酸緩沖液稀釋；原液用乙醇助溶，磷酸緩沖液稀釋；菌懸液制備；菌懸液制備；DES和菌懸液混合振蕩；和菌懸液混合振蕩；終止反終止反應(yīng)；平皿分離。應(yīng)；平皿分離。4. 乙烯亞氨乙烯亞氨 高濃度短時(shí)間處理高濃度短時(shí)間處理三、脫氨基（亞硝氨為例）三、脫氨基（亞硝氨為例）（一）亞硝酸的誘變機(jī)制（一）亞硝酸的誘變機(jī)制 亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的亞硝酸可直接作用于正在復(fù)制或未復(fù)制的DNA分分子，脫去堿基中的子，脫去堿基中的氨基變成酮基氨基變成酮基，改變，改變堿基氨氫鍵堿基氨氫鍵的的電位，引起轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。電位，引起轉(zhuǎn)換而發(fā)生變異。 還可引起還可引起DNA兩條單鏈之間交聯(lián)。兩條單鏈之間交聯(lián)。 （二）亞

33、硝酸的處理方法（二）亞硝酸的處理方法1. 試劑的配制試劑的配制（1）1 mol/L pH 4.5 醋酸緩沖液醋酸緩沖液（2）0.1 mol/L亞硝酸鈉溶液亞硝酸鈉溶液（3）0.07 mol/L pH 8.6磷酸氫二鈉溶液磷酸氫二鈉溶液2. 處理方法處理方法 孢子懸液、醋酸緩沖液、亞硝酸鈉溶液混合保溫，孢子懸液、醋酸緩沖液、亞硝酸鈉溶液混合保溫，加入磷酸氫二鈉溶液，降加入磷酸氫二鈉溶液，降pH終止反應(yīng)。稀釋涂平板。終止反應(yīng)。稀釋涂平板。亞硝酸鈉濃度：孢子亞硝酸鈉濃度：孢子0.025mol/L；細(xì)菌細(xì)菌0.05mol/L。四、移碼誘變劑四、移碼誘變劑 移碼誘變劑與移碼誘變劑與DNA相互結(jié)合引起堿基

34、增添或缺相互結(jié)合引起堿基增添或缺失而造成突變。失而造成突變。 移碼誘變劑：移碼誘變劑：吖吖啶黃、啶黃、吖吖啶橙、原黃素、啶橙、原黃素、ICR-171、ICR191等等1. 吖吖啶化合物的誘變機(jī)制啶化合物的誘變機(jī)制 移碼突變移碼突變2. 吖吖啶黃的性質(zhì)和使用方法啶黃的性質(zhì)和使用方法 加入到培養(yǎng)基中制成平板或加到培養(yǎng)液里。加入到培養(yǎng)基中制成平板或加到培養(yǎng)液里。 五、羥化劑五、羥化劑羥胺（羥胺（HA）1. 羥胺的誘變機(jī)制：羥胺的誘變機(jī)制：G:CA:T2. 羥胺的處理方法羥胺的處理方法 六、金屬鹽類六、金屬鹽類 如如氯化鋰、硫酸錳氯化鋰、硫酸錳等。等。 氯化鋰稱之為助誘變劑，氯化鋰是白色粉末，易氯化鋰稱之為助誘變劑，氯化鋰是白色粉末，易溶于水，使用時(shí)通常加到培養(yǎng)基中。溶于水，使用時(shí)通常加到培養(yǎng)基中。 為了速免受破壞倒平板時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)基溫度冷卻為了速免受破壞倒平板時(shí)，