口服百草枯建立帕金森病模型及其評(píng)價(jià)研究

1、口服百草枯建立帕金森病模型及其評(píng)價(jià)研究羅烘權(quán)1，袁進(jìn)1，徐名襯1，鄭春華1，王玉玨1，吳麗紅2，顧為望11南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東省廣州市 510515；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣東省廣州市510140 摘要 目的：通過(guò)模擬人類(lèi)經(jīng)消化道長(zhǎng)期慢性暴露于百草枯的方式研究其對(duì)大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的影響，建立大鼠帕金森病模型及對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：將大鼠隨機(jī)分為高劑量組（20mg/kg百草枯），中劑量組（10mg/kg百草枯），低劑量組（5mg/kg百草枯）和對(duì)照組（生理鹽水），每組16只，連續(xù)灌胃4個(gè)月后運(yùn)用行為學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、中腦黑質(zhì)部及肺部病理學(xué)觀察、HPLC法檢測(cè)紋狀體多巴胺及其代謝物含量等

2、進(jìn)行分析及評(píng)價(jià)。結(jié)果：給藥4個(gè)月后，與對(duì)照組相比，中劑量組大鼠反應(yīng)遲鈍、動(dòng)作僵硬、四肢震顫、學(xué)習(xí)記憶能力減退（P<0.01）、中腦黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞明顯萎縮、紋狀體中的多巴胺及高香草酸含量分別下降了20.0%（P<0.01）和11.3%（P<0.01）且肺組織有明顯損傷；低劑量組與對(duì)照組相比上述變化不明顯。結(jié)論：通過(guò)口服百草枯可建立具典型行為學(xué)變化和大腦黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)受損的大鼠帕金森病模型，這將為帕金森病的機(jī)制及防治研究提供理想的模型動(dòng)物。關(guān)鍵詞 口服； 百草枯； 帕金森?。?大鼠The study of establishing the model of Parki

3、nson's disease and its evaluation by taking orally paraquatLUO Hong-quan1，YUAN Jin1，XU Ming-chen1，ZHENG Chun-hua1，WANG Yu-jue1，WU Li-hong2，GU Wei-wang1. * Department of Laboratory Animal Center, Southern Medical University, Guangzhou, 510515, China. 2Stomatology Hospital of Guangzhou Medical Uni

4、versity, Guangzhou, 510140, China.【Abstract】 Objective To study its effect on rat nigrostriatal system and establish the rat model of Parkinson's disease and its evaluation by simulating human chronic exposure to paraquat through the digestive tract. Methods Rats were divided into high dose grou

5、p (20 mg/kg paraquat, n = 16)，medium dose group(10 mg/kg paraquat, n = 16)，low dose group (5 mg/kg paraquat, n = 16) and the control group (normal saline, n = 16). Intragastric 4 months. We apply the behavioral detection system, the midbrain nigra and lung pathology observation, detecting the levels

6、 of striatum dopamine and related metabolites by HPLC etc. to analyze and evaluate it. Results After 4 months，compared with the control group, the performance of the low-dose group were normal，and some of rats in high dose group are unresponsive, stiff, tremulous. And the ability of learning and mem

7、ory loss compared with the the control group (P = 0.001). Moreover, Compared with the control group，the substantia nigra pars compacta dopaminergic neurons was reduced significantly. DA in the striatum and its metabolites HVA levels fell by 20.0%(P<0.01) and 11.3% (P<0.01) respectively and the

8、 lung tissue damages significantly. These changes in the low-dose group were not obvious. Conclusion The way of taking orally paraquat can establish the rat model of Parkinson's disease with the brain nigra dopaminergic nervous system damage, typical behavior changes, and it provides an ideal an

9、imal model for the research of mechanism and prevention of Parkinson's disease.【Key words】 Take orally； Paraquat； Parkinson's disease； Rat帕金森?。≒arkinson disease, PD）又稱(chēng)震顫麻痹（paralysis agitans, shaking palsy），是中老年人常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)椎體外系退行性疾病。主要的病理特征是黑質(zhì)致密部大量多巴胺能神經(jīng)元的壞死，紋狀體內(nèi)DA(dopamine，DA)含量減少。臨床以靜止性震顫、肌強(qiáng)直

10、、姿勢(shì)異常和運(yùn)動(dòng)遲緩以及平衡功能障礙為主要表現(xiàn)，可伴有記憶力減退、抑郁等精神障礙。PD與年齡、遺傳、環(huán)境等因素相關(guān)，發(fā)病率有逐年增加并有年輕化的趨勢(shì)。近年來(lái)，農(nóng)藥（如百草枯）在飲水、食品中的殘留被認(rèn)為是PD的重要誘發(fā)因素1-2。有研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)外農(nóng)民以及除草劑（如百草枯）暴露人群中帕金森病的發(fā)病率會(huì)相對(duì)增加3。百草枯（paraquat，PQ），也叫克蕪蹤、對(duì)草快等，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。其結(jié)構(gòu)與經(jīng)典PD造模劑1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrehydropyridine，MPTP）及其活性代謝產(chǎn)物MPP+極為相似，具有與MP

11、TP相似的神經(jīng)毒性作用。百草枯可通過(guò)皮膚接觸或吸入、經(jīng)服食沾有該除草劑的食物、飲用水進(jìn)入人體內(nèi)。國(guó)外已經(jīng)報(bào)道百草枯的暴露是帕金森病的一個(gè)重要致病因素4。國(guó)內(nèi)外常通過(guò)腹腔或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯建立小鼠、大鼠PD 模型5-7，這與人類(lèi)的主要經(jīng)口暴露方式相差甚遠(yuǎn)。通過(guò)大鼠口服百草枯建立PD模型的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)口服途徑使大鼠較長(zhǎng)時(shí)間暴露于百草枯，模擬人類(lèi)長(zhǎng)期、慢性暴露于該除草劑建立大鼠的PD模型， 為PD的發(fā)病機(jī)制及其防治研究提供理想的模型動(dòng)物。1 材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠（，220-250g）64只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可

12、證號(hào)：SCXK粵2011-0015）。 1.1.2 主要試劑 百草枯（20%， 南京杜邦生物化工有限公司）；DA、HVA、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為國(guó)產(chǎn)HPLC色譜純，高氯酸，鹽酸和檸檬酸三鈉為國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為三重蒸餾水。1.1.3 主要儀器 RC5C高速低溫離心機(jī)（美國(guó)杜邦公司）；PHS-2C精密酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；Waters HPLC系統(tǒng)（510輸液泵，420熒光檢測(cè)器，Baseline810色譜工作站）；RD1112-OF-R-1鼠博士曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（上海移數(shù)信息科技有限公司）；RD1101-MWM-G鼠博士MORRIS水迷宮視頻分析

13、系統(tǒng)（上海移數(shù)信息科技有限公司）；海力孚HF-240全自動(dòng)生化分析儀。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組16只，每天分別按生理鹽水，5mg/kg百草枯，10mg/kg百草枯和20mg/kg百草枯給藥，連續(xù)灌胃4個(gè)月，監(jiān)測(cè)大鼠實(shí)驗(yàn)前后體重變化情況。1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)（1） 日常行為觀察 主要觀察動(dòng)物精神狀況，行為動(dòng)作，給藥前后有無(wú)異常表現(xiàn)等。（2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 4個(gè)月后，每組隨機(jī)抽取8只大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，把大鼠分別放入100cm×100cm×45cm的曠場(chǎng)箱內(nèi)，通過(guò)動(dòng)物曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)采集分析大鼠在5min

14、內(nèi)的運(yùn)動(dòng)總路程和中央活動(dòng)時(shí)間。（3） 水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)4 天，4次/天，每次分別從4個(gè)不同象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺(tái)的時(shí)間，即為其逃避潛伏期。若大鼠在90s內(nèi)未找到平臺(tái)則由實(shí)驗(yàn)者將其引向平臺(tái)，潛伏期記為90s。大鼠爬上平臺(tái)后，讓其在上休息15 s，之后再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。將4次/天的算術(shù)平均值記為當(dāng)天的成績(jī)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：于第5天撤除平臺(tái)，在第1象限將大鼠面壁投入水池，視頻分析系統(tǒng)記錄其2 min內(nèi)水中游泳路徑及穿過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)。 各組大鼠肝腎功能的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)三組大鼠中每組隨機(jī)抽取8只，用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后通過(guò)眼眶靜脈叢采取血液

15、1.5ml，分離血清，測(cè)定ATL、BUN、Cr。 病理學(xué)觀察 將每組隨機(jī)抽取6只大鼠，采集肺、中腦組織并用10%甲醛固定后制作石蠟切片，進(jìn)行HE染色。觀察各組大鼠肺、中腦黑質(zhì)部組織病理學(xué)變化。1.2.5 HPLC-FD法檢測(cè)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量（1） 色譜條件 采用Waters-510泵；Nucleosil-C18（4mm×250mm）色譜柱；流動(dòng)相：20.0mmol/L檸檬酸三鈉緩沖液（用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.5）：甲醇：乙腈=85:10:5，經(jīng)0.45m的濾膜真空抽濾；脫氣，流速1.0ml/min；柱溫：室溫。熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)280nm，發(fā)射波長(zhǎng)315nm；以峰面積定

16、量。（2） 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的制備與測(cè)定 標(biāo)準(zhǔn)品制備：DA、HVA、5-HT分別溶解于0.1mol/L HClO4中，濃度為0.5g/L,貯存于-20冰箱中；分析時(shí)將上述溶液稀釋成20g/ L作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品制備：每組大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后快速斷頭取腦，在預(yù)冷的0.1mol/L PBS緩沖液中剝離出紋狀體，經(jīng)干冰固化稱(chēng)重后迅速-80冰凍保存。測(cè)定時(shí)取出標(biāo)本置于勻漿器中，加入1ml預(yù)冷的HClO4，制成勻漿。于臺(tái)式冷凍離心機(jī)中15000g離心20min，取上清液0.22m濾器過(guò)濾進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行定量，計(jì)算出樣本中各項(xiàng)指標(biāo)的濃度，并表示為ng/mg組織（濕重）。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

17、 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行分析，組間比較為Independent sample t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用x±s 表示，P<0.05則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2 結(jié)果2.1 日常行為觀察 給藥一周后，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)給藥的兩組部分大鼠出現(xiàn)拉稀和鼻孔出血；兩周后中劑量組大鼠會(huì)出現(xiàn)呼吸急促，甚至出現(xiàn)嚎叫的現(xiàn)象、喂藥后豎毛、翹尾和異?；顫?隨時(shí)間推移，以上癥狀逐漸減輕；四周后，中劑量組大鼠呆滯、反應(yīng)遲鈍；十周后，中劑量組部分大鼠動(dòng)作僵硬和四肢震顫,且維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；而低劑量組大鼠整個(gè)過(guò)程沒(méi)有明顯上述變化。另外，高劑量組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)大量死亡（圖1），4個(gè)月后所剩大鼠數(shù)量無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，因

18、此，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)把高劑量組剔除2.2 大鼠體重的變化 由表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，造模前各組大鼠體重比較無(wú)差異（P>0.05），造模后各組大鼠體重都有明顯的增加,但組間差異不顯著，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 由圖2結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠5min內(nèi)中央活動(dòng)時(shí)間是中劑量組的13.69倍，差異顯著（P=0.043），低劑量組的中央活動(dòng)時(shí)間與對(duì)照組相比差異不顯著（P=0.248）。各組大鼠5min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總路程分別為(2610.41±633.55)cm，(2556.90±837.97)cm，(2507.69±780.07)cm，雖然對(duì)照組>低

19、劑量組>中劑量組,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。2.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)：在連續(xù)的4d的訓(xùn)練中，中劑量組和低劑量組與對(duì)照組相比，每天平均逃避潛伏期均增加，但是只有中劑量組與對(duì)照組比較（P值分別為0.010,0.028,0.036,0.021）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而低劑量組與對(duì)照組比較（P值分別為0.049,0.024,0.085,0.091），兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，中劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)（2.14±0.69）與對(duì)照組（3.86±0.69）相比明顯減少，差異極顯著（P<

20、;0.01），但是低劑量組（3.14±1.57）與對(duì)照組相比差異不顯著（P=0.291）。2.5 肝腎功能檢測(cè) 采血后測(cè)定BUN，Cr以及ALT指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表2。各組之間的腎功能（BUN、Cr）無(wú)明顯差異（P>0.05）,而中劑量組的ALT雖然比低劑量組和對(duì)照組有所增高，但均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。2.6 病理學(xué)觀察2.6.1 中腦病理觀察 由圖4中A、B、C可以看出，對(duì)照組大鼠大致正常，中劑量組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞大量萎縮，色素大量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，低劑量組大鼠有輕度上述變化。 肺組織病理觀察 由圖4中D、E、F結(jié)果顯示中劑量組大鼠肺泡腔嚴(yán)重淤血，肺泡上皮壞死

21、脫落,肺泡間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤(rùn)，低劑量組大鼠肺組織損傷程度較輕，而對(duì)照組大鼠正常。2.7 紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量 通過(guò)HPLC檢測(cè)測(cè)定結(jié)果顯示，中劑量組大鼠4個(gè)月后紋狀體中的DA及HVA含量較對(duì)照組均明顯下降，分別下降20.0%（P<0.01）和11.3%（P<0.01）。而低劑量組大鼠紋狀體中的DA和HVA含量較對(duì)照組也有下降，但差異不顯著（P分別為0.108和0.197）。5-HT檢測(cè)結(jié)果顯示,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。3 討論P(yáng)D是常見(jiàn)于中老年人群的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，在我國(guó)大于65歲以上人群中的PD患病率為1.7%，且有逐年遞增的趨勢(shì)8。最近

22、一項(xiàng)研究表明，到 2030 年 50 歲以上的中老年人患 PD 的人數(shù)會(huì)增加一倍，估計(jì)相當(dāng)于全世界 900 萬(wàn)的人口9。PD作為嚴(yán)重危害老年人身體健康的神經(jīng)退行性疾病，對(duì)其進(jìn)行研究具有重要的國(guó)民保健和社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義。近年來(lái)，雖然農(nóng)藥種類(lèi)和使用方法不斷更新改進(jìn)，用藥水平和殘留水平也在下降，但農(nóng)產(chǎn)品和加工食品中種類(lèi)繁多的農(nóng)藥殘留，給食品安全問(wèn)題帶來(lái)了隱患。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常接觸農(nóng)藥、除草劑（如百草枯）的農(nóng)民，飲用被污染的河水、井水的居民，其PD發(fā)病率明顯增高10。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究不斷證實(shí)了百草枯具有致PD的神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)灌胃給予大鼠百草枯稀釋液模擬人類(lèi)經(jīng)消化道暴露該除草劑的方式，大鼠出現(xiàn)了

23、PD的臨床癥狀和中腦病變。與大量報(bào)道的其他研究方法一樣，大鼠出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)遲緩、四肢震顫、腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞明顯萎縮、黑質(zhì)神經(jīng)元受損、膠質(zhì)細(xì)胞增生、DA及其代謝物含量降低等一系列變化。有報(bào)道稱(chēng)帕金森患者焦慮障礙的發(fā)生率為3.6%-40%11，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明了口服中劑量PQ的大鼠在進(jìn)入一個(gè)廣闊的空間后會(huì)產(chǎn)生一定程度的焦慮，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了其學(xué)習(xí)記憶能力也相對(duì)減退，這與對(duì)照組形成了鮮明的對(duì)比；從該研究各結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)采用的方法可以建立具典型PD樣行為學(xué)表現(xiàn)的疾病模型。人們常用腹腔或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯的方法進(jìn)行制備帕金森模型5-7，采用單次或短期較高劑量多次給藥誘導(dǎo)出神經(jīng)元壞死

24、的模型，這與生活中人們暴露百草枯的方式完全不一致；且所用藥物大多為試劑級(jí)，價(jià)格昂貴；制備技術(shù)上，腦內(nèi)注射需立體定位特殊設(shè)備，有一定技術(shù)難度。雖丁正同等12已經(jīng)采用該方法在小鼠進(jìn)行研究，同為嚙齒類(lèi)動(dòng)物，來(lái)源容易，觀察方便，但小鼠個(gè)體小，在取腦組織研究等方面相對(duì)較難。本研究方法模擬了人類(lèi)暴露該除草劑的方式，采用商用百草枯水劑，價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，符合了PD患者自然病程較長(zhǎng)，病情進(jìn)展緩慢的特點(diǎn)，較經(jīng)濟(jì)有效的進(jìn)行模型制備。近年來(lái)百草枯其神經(jīng)毒性作用被廣泛研究，但肺是百草枯毒性作用的靶器官。有研究表明長(zhǎng)期給予低劑量的百草枯，其慢性毒性作用主要對(duì)基底節(jié)造成損害而不產(chǎn)生肺毒性作用3。但本研究結(jié)

25、果顯示，大鼠肺泡腔嚴(yán)重淤血，肺泡上皮壞死脫落,肺泡間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤(rùn)，這表明該研究方法會(huì)對(duì)肺組織產(chǎn)生毒副作用，該毒副作用可能也是高劑量組的高死亡率原因。另外，雖然肝臟和腎臟是百草枯的主要代謝器官，但檢測(cè)結(jié)果顯示本研究方法尚未損傷動(dòng)物肝腎功能，這與相關(guān)報(bào)道12是一致的。綜上所述，百草枯可能是導(dǎo)致PD的環(huán)境因素之一。SD大鼠通過(guò)口服方式暴露于百草枯可以發(fā)生典型的PD樣改變，行為學(xué)方面出現(xiàn)日常活動(dòng)減少，震顫，學(xué)習(xí)記憶能力下降等；形態(tài)學(xué)方面大鼠中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)細(xì)胞減少明顯；生化方面大鼠紋狀體中DA及其代謝物HVA降低明顯等等。這些結(jié)果提示了，通過(guò)亞慢性暴露于百草枯可導(dǎo)致大腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生

26、明顯的變化，說(shuō)明該方法建立PD模型是有效可行的，這為PD的機(jī)制和治療研究奠定基礎(chǔ)。4 參考文獻(xiàn)1 Hisahara S, Shimohama S. Toxin一Induced and Genetic Animal Models of Parkinsons Disease. Parkinsons Disease,2011:1-142 Liou HH, Tsai MC,Chen CJ,et al. Environmental risk factors and Parkinson s disease: a case-control study in Taiwan. Neurology, 1997,4

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31、9-120.11 Weintraub D, Comella CL, Horn S. Parkinsons diseasePart 3: Neuropsychiatric symptoms. Am J Manag Care, 2008, 14 (2 Suppl):S59-69. 12 丁正同，任惠民，蔣雨平，等 百草枯對(duì)小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)的影響J. 復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2001, 28（1）：28-31.圖1 各組大鼠死亡情況比較Fig.1 Mortality in Each Group of Rats表1 造模前后各組大鼠的體重比較（g）Table 1 Body Weight（g）組別 造模前 造模后 對(duì)照組 239.38±2.72 539.38