遺傳育種學(xué)第十七章分子育種

1、第十七章第十七章 分子育種分子育種1. 分子育種的概念與程序分子育種的概念與程序1.1 概念概念 按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體外過體外 DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù) 和和 DNADNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，有目轉(zhuǎn)移技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在短時(shí)間內(nèi)的地改造生物種性，使現(xiàn)有物種在短時(shí)間內(nèi)趣于完善，以創(chuàng)造出新的生物類型的技術(shù)體趣于完善，以創(chuàng)造出新的生物類型的技術(shù)體系系 ，亦即基因工程。，亦即基因工程。 1.2 1.2 植物基因工程植物基因工程 植物基因工程是近植物基因工程是近2020年來隨著年來隨著DNADNA重組重組技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培

2、養(yǎng)技術(shù)、植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)而發(fā)展起來的現(xiàn)代生物技術(shù)。技術(shù)而發(fā)展起來的現(xiàn)代生物技術(shù)?；蚬こ痰幕靖拍罨蚬こ痰幕靖拍钷D(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化（Transformation)Transformation)：是指將外源：是指將外源DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。復(fù)制子復(fù)制子（Replicon)Replicon)：具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)：具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) (ori) (ori) 的的DNADNA分子稱為一個(gè)復(fù)制子。分子稱為一個(gè)復(fù)制子。載體載體（VectorVector）：能與外源）：能與外源DNADNA連接并實(shí)現(xiàn)連接并實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的復(fù)制子。轉(zhuǎn)化的復(fù)制子。重組子重組子（Recombinan

3、tRecombinant）：連接了外源）：連接了外源DNADNA分子的復(fù)制子。分子的復(fù)制子。1.3 1.3 基因工程的基本步驟基因工程的基本步驟重組子的檢測重組子的檢測重組子的檢測重組子的檢測1.4 觀賞植物基因工程的目的基因觀賞植物基因工程的目的基因觀賞性觀賞性: :開花、花色、花型、花徑相關(guān)基因。開花、花色、花型、花徑相關(guān)基因?？鼓嫘钥鼓嫘? :抗蟲、抗旱、耐鹽堿、抗寒相關(guān)基因抗蟲、抗旱、耐鹽堿、抗寒相關(guān)基因切花壽命切花壽命花期調(diào)控花期調(diào)控2. 基本技術(shù)及原理基本技術(shù)及原理2.1 DNA重組技術(shù)重組技術(shù) 將外源將外源DNA片段與載體分子連接，形片段與載體分子連接，形成重組成重組DNA分子，

4、再將重組子導(dǎo)入寄主細(xì)分子，再將重組子導(dǎo)入寄主細(xì)胞內(nèi)。這一技術(shù)體系稱為胞內(nèi)。這一技術(shù)體系稱為DNA重組技術(shù)。重組技術(shù)。2.1.1 2.1.1 目的基因的分離（或合成）目的基因的分離（或合成） 常用的幾種目的基因：常用的幾種目的基因： 基因工程的工具酶基因工程的工具酶: 限制性內(nèi)切酶（限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease) DNA連接酶（連接酶（ligase) 末端修飾酶末端修飾酶2.1.2 基因工程的載體系統(tǒng)基因工程的載體系統(tǒng)質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體病毒載體病毒載體w質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒圖譜及質(zhì)粒構(gòu)建啟動(dòng)子啟動(dòng)子 外源基因外源基因 終止子終止子 啟動(dòng)子啟動(dòng)

5、子 報(bào)告基因報(bào)告基因 終止子終止子 （標(biāo)記基因）（標(biāo)記基因） 目的片段目的片段 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 載體載體植物基因工程的報(bào)告基因：植物基因工程的報(bào)告基因：定義定義:特點(diǎn)特點(diǎn): 在選擇培養(yǎng)基上生長在選擇培養(yǎng)基上生長 報(bào)告基因與目的基因嵌和表達(dá)報(bào)告基因與目的基因嵌和表達(dá) 研究調(diào)控區(qū)研究調(diào)控區(qū)報(bào)告基因的種類報(bào)告基因的種類:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ Neomycine Neomycine phosphotransferase phosphotransferase II, NPT II) II, NPT II)基因基因氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Chloraphenicol Ch

6、loraphenicol acetyltransferase, CATacetyltransferase, CAT）基因）基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hygromycin Hygromycin phosphotransferase, Hptphosphotransferase, Hpt）基因）基因 葡萄糖酸苷酶葡萄糖酸苷酶 （ Glucuronidase, GUS Glucuronidase, GUS）基因）基因熒光素酶（熒光素酶（Luceferase, LucLuceferase, Luc）基因）基因抗除草劑（抗除草劑（Basta, BarBasta, Bar）基因）基因2.2.

7、1 外源外源DNADNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法 載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法：載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法： 致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 DNADNA直接導(dǎo)入法：直接導(dǎo)入法： 化學(xué)法：化學(xué)法：PEG誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 電激法介導(dǎo)電激法介導(dǎo) 顯微注射顯微注射 媒體介導(dǎo)法媒體介導(dǎo)法 脂質(zhì)體介導(dǎo)脂質(zhì)體介導(dǎo) 超聲波介導(dǎo)超聲波介導(dǎo) 基因槍介導(dǎo)基因槍介導(dǎo)致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TiTi質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 含有含有TiTi質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物的質(zhì)粒的致癌農(nóng)桿菌與一些植物的細(xì)胞接觸后，細(xì)胞接觸后，TiTi質(zhì)

8、粒的一部分（質(zhì)粒的一部分（T-DNAT-DNA）可以）可以導(dǎo)入植物細(xì)胞，整和到植物基因組導(dǎo)入植物細(xì)胞，整和到植物基因組DNADNA隨其復(fù)隨其復(fù)制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列制。根據(jù)這一特性可構(gòu)建一系列TiTi質(zhì)粒載體，質(zhì)粒載體， 與含目的片段的與含目的片段的DNADNA片段重組，導(dǎo)入致癌農(nóng)桿片段重組，導(dǎo)入致癌農(nóng)桿菌，再采用葉盤法、原生質(zhì)體培養(yǎng)法、細(xì)胞菌，再采用葉盤法、原生質(zhì)體培養(yǎng)法、細(xì)胞培養(yǎng)法，通過致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞。培養(yǎng)法，通過致癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入植物細(xì)胞。 TiTi質(zhì)粒質(zhì)粒 根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，根瘤農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為共價(jià)閉合環(huán)狀的為共價(jià)閉合環(huán)狀的DNADNA分子。分

9、子。TiTi質(zhì)粒的功能質(zhì)粒的功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；參與寄主細(xì)胞合成激素的能力；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤；賦予寄主分解冠癭堿的能力；賦予寄主分解冠癭堿的能力；決定寄主范圍。決定寄主范圍。TiTi質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)T-DNAT-DNA區(qū)區(qū)Vir Vir 區(qū)區(qū)Con Con 區(qū)區(qū)Ori Ori 區(qū)區(qū)Vir 區(qū)區(qū)LBRBETi PlasmidT-DNAT-DNA區(qū)區(qū)Ori Ori 區(qū)區(qū)Con Con 區(qū)區(qū)Vir Vir 區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能VirVir區(qū)是一段長度為區(qū)是一段長度

10、為35KB35KB操縱子操縱子包含六個(gè)基因：包含六個(gè)基因： VirAVirA、VirB VirB 、 VirC VirC 、 VirD VirD 、 VirE VirE 、 VirGVirG。核心區(qū)核心區(qū)左邊界左邊界右邊界右邊界T-DNAT-DNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能LBRBLBRB植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一元載體（順勢載體）一元載體（順勢載體）雙元載體（反式載體）雙元載體（反式載體）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建P G2 T NOSAmpAmpr r P G1 T目的基因目的基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因Vir區(qū)區(qū)目的基因目的基

11、因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因報(bào)告基因，選擇標(biāo)記基因LBRB農(nóng)桿菌導(dǎo)入方法 共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法 葉盤轉(zhuǎn)化法葉盤轉(zhuǎn)化法 整株感染法整株感染法 原生質(zhì)體共培養(yǎng)法原生質(zhì)體共培養(yǎng)法基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作：l基本原理基本原理l操作步驟操作步驟l優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l影響轉(zhuǎn)化效率的因素影響轉(zhuǎn)化效率的因素操作步驟：操作步驟：預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)基因植株篩選和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株篩選和培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定轉(zhuǎn)基因植株的鑒定田間釋放田間釋放影響轉(zhuǎn)化效率的因素：影響轉(zhuǎn)化效率的因素：金屬微粒金屬微粒DNADNA沉淀輔助劑沉淀輔助劑DNADNA純度和濃度純度和濃度微彈速度微彈速度植物材料植物材料基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：基因槍法的優(yōu)點(diǎn)：無宿

12、主限制；無宿主限制；靶受體類型廣泛；靶受體類型廣泛；可控度高；可控度高；操作簡便。操作簡便。問題：轉(zhuǎn)化效率低；轉(zhuǎn)化效率低；嵌合體多；嵌合體多；穩(wěn)定性差，瞬時(shí)表達(dá)；穩(wěn)定性差，瞬時(shí)表達(dá)；外源基因沉默；外源基因沉默；整合機(jī)理不詳。整合機(jī)理不詳。PEG誘導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）、多聚鳥苷酸、磷酸）、多聚鳥苷酸、磷酸鈣在高鈣在高PHPH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體撲獲值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體撲獲DNADNA分分子。子。步驟：步驟：共保溫；共保溫；稀釋稀釋PEGPEG；非選擇培養(yǎng)；非選擇培養(yǎng)；選擇培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化順利，對細(xì)胞傷害?。晦D(zhuǎn)化順利，對細(xì)胞傷害?。槐苊馇逗象w的生成；避免

13、嵌合體的生成；易于選擇；易于選擇；便于進(jìn)行理論研究；便于進(jìn)行理論研究；受體廣泛。受體廣泛。脂質(zhì)體介導(dǎo)：脂質(zhì)體介導(dǎo)：用化學(xué)物質(zhì)將用化學(xué)物質(zhì)將DNADNA包裹成球體，通包裹成球體，通過植物原生質(zhì)體的吞過植物原生質(zhì)體的吞噬作用，把噬作用，把DNADNA導(dǎo)入導(dǎo)入細(xì)胞。細(xì)胞。電激法介導(dǎo)： 利用高壓脈沖利用高壓脈沖作用，在原生質(zhì)體作用，在原生質(zhì)體上形成可逆的瞬間上形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外通道，從而促進(jìn)外源源DNADNA的攝取。的攝取。2.2.2 轉(zhuǎn)基因操作的受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因操作的受體系統(tǒng)高頻再生體系的建立：高頻再生體系的建立： 愈傷組織再生系統(tǒng)愈傷組織再生系統(tǒng) 直接分化再生系統(tǒng)直接分化再生系統(tǒng) 原生質(zhì)

14、體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體再生系統(tǒng) 胚狀體再生系統(tǒng)胚狀體再生系統(tǒng) 生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)生殖細(xì)胞再生系統(tǒng)抗生素敏感實(shí)驗(yàn)：抗生素敏感實(shí)驗(yàn)： 抑制細(xì)菌生長抑制細(xì)菌生長 殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞農(nóng)桿菌敏感實(shí)驗(yàn)：農(nóng)桿菌敏感實(shí)驗(yàn)：2.3 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植株的再生 恢復(fù)生長 篩選培養(yǎng) 植株再生2.4 轉(zhuǎn)基因植物的鑒定轉(zhuǎn)基因植物的鑒定 遺傳鑒定遺傳鑒定 表達(dá)鑒定表達(dá)鑒定 表型分析鑒定表型分析鑒定利用報(bào)告基因利用報(bào)告基因Northern Northern 雜交雜交Western Western 雜交雜交 直接鑒定直接鑒定DNADNA分子是否整合分子是否整合到基因組上。到基因組上。1 1）擴(kuò)增目的片段；）擴(kuò)增目的

15、片段；2 2）雜交信號(hào)鑒定。）雜交信號(hào)鑒定。（Southern 雜交雜交）鑒定步驟：鑒定步驟：l篩選鑒定（利用質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記）篩選鑒定（利用質(zhì)粒上的選擇標(biāo)記）l報(bào)告基因鑒定（利用質(zhì)粒上的報(bào)告基因）報(bào)告基因鑒定（利用質(zhì)粒上的報(bào)告基因）l遺傳鑒定遺傳鑒定l生長試驗(yàn)生長試驗(yàn) DNA鑒定鑒定- southern RNA鑒定鑒定- northern蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定- western適宜外植體的選擇及再生體系的建立適宜外植體的選擇及再生體系的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇遺傳轉(zhuǎn)化操作遺傳轉(zhuǎn)化操作l 載體介導(dǎo)的載體介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化方法l DNA直接導(dǎo)入

16、法直接導(dǎo)入法l 種質(zhì)系統(tǒng)法種質(zhì)系統(tǒng)法選擇培養(yǎng)選擇培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株鑒定轉(zhuǎn)基因植株鑒定獲得再生植株獲得再生植株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植株的繁殖與應(yīng)用利用報(bào)告基因利用報(bào)告基因Southern 雜交雜交Northern 雜交雜交Western 雜交雜交3. 基因工程的安全性基因工程的安全性安全問題的考慮：安全問題的考慮：工程菌株的處理工程菌株的處理轉(zhuǎn)基因植物的釋放轉(zhuǎn)基因植物的釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全轉(zhuǎn)基因作物本身成為雜草；轉(zhuǎn)基因作物本身成為雜草；轉(zhuǎn)基因作物使其親緣野生種成為雜草或超級雜草；轉(zhuǎn)基因作物使其親緣野生種成為雜草或超級雜草；轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生新的病毒

17、或疾??；轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生新的病毒或疾??；轉(zhuǎn)基因作物對非目標(biāo)生物的危險(xiǎn)；轉(zhuǎn)基因作物對非目標(biāo)生物的危險(xiǎn)；轉(zhuǎn)基因作物作為外來種對新生境的入侵，使生物多轉(zhuǎn)基因作物作為外來種對新生境的入侵，使生物多樣性受到威脅；樣性受到威脅；轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)過程的影響：轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)過程的影響：其它一些不可預(yù)計(jì)的風(fēng)險(xiǎn)。其它一些不可預(yù)計(jì)的風(fēng)險(xiǎn)。 轉(zhuǎn)基因植物的風(fēng)險(xiǎn)：轉(zhuǎn)基因植物的風(fēng)險(xiǎn)：生物安全的管理：生物安全的管理：法國為對遺傳修飾生物體法國為對遺傳修飾生物體(GMO)(GMO)的評價(jià)和的評價(jià)和立法成立了兩個(gè)專門委員會(huì)。立法成立了兩個(gè)專門委員會(huì)。u第一個(gè)是遺傳工程委員會(huì)，成立于第一個(gè)是遺傳工程委員會(huì)，

18、成立于19751975年，任務(wù)集中于實(shí)驗(yàn)室的重組年，任務(wù)集中于實(shí)驗(yàn)室的重組DNADNA的研究的研究u19861986年又成立了生物分子工程委員會(huì)，年又成立了生物分子工程委員會(huì)，它的任務(wù)是評價(jià)遺傳修飾生物體的大田試驗(yàn)、它的任務(wù)是評價(jià)遺傳修飾生物體的大田試驗(yàn)、釋放以及商品化過程的安全問題。釋放以及商品化過程的安全問題。 進(jìn)入進(jìn)入9090年代特別是年代特別是19921992年聯(lián)合國環(huán)境年聯(lián)合國環(huán)境與發(fā)展大會(huì)的召開，更加促進(jìn)了國際上對與發(fā)展大會(huì)的召開，更加促進(jìn)了國際上對生物安全立法工作的重視，特別是大會(huì)由生物安全立法工作的重視，特別是大會(huì)由許多國家簽署的兩個(gè)綱領(lǐng)性文件許多國家簽署的兩個(gè)綱領(lǐng)性文件2121世紀(jì)世紀(jì)議程議程和和生物多樣性公約生物多樣性公約均在有關(guān)條均在有關(guān)條款中提到了生物技術(shù)安全問題。款中提到了生物技術(shù)安全問題。 19931993年，在原國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)領(lǐng)年，在原國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)領(lǐng)導(dǎo)下成立了國家生物遺傳工程安全委員會(huì)，導(dǎo)下成立了國家生