兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)復(fù)合β－磷酸三鈣進(jìn)行胸椎后側(cè)融合實驗

1、兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)復(fù)合磷酸三鈣進(jìn)行胸椎后側(cè)融合實驗研究               作者：許衛(wèi)兵 賈連順 盧建熙 盧旭華 滕紅林 顧宇彤 楊建東 陳長青 【關(guān)鍵詞】  脊柱融合    摘要：目的評價磷酸三鈣復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為骨移植替代物進(jìn)行脊柱融合的效果。方法60只兔子分四組進(jìn)行胸椎后路融合：組（組織工程化骨即TCP復(fù)合BMSCs），組（TCP自體紅骨髓），組（單純TCP），組（自體髂骨）。術(shù)后12周處死其余

2、動物進(jìn)行放射學(xué)、手工力學(xué)和組織學(xué)檢查。結(jié)果從影像學(xué)和手工力學(xué)比較，組的融合率高于、組且有統(tǒng)計學(xué)差異。組織學(xué)上，組新骨形成量較多，陶瓷微孔內(nèi)部充滿新生骨;組骨小梁形成量較組少, 為新生骨與纖維組織混雜；組陶瓷骨顆粒微孔內(nèi)多為結(jié)締組織，新生骨的量少，只見少量新生骨貼附于陶瓷骨表面; 組在椎板與移植骨的交界處有稀疏的新生骨小梁形成。結(jié)論TCP復(fù)合BMSCs是脊柱融合自體骨的良好替代物。關(guān)鍵詞：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；磷酸三鈣；脊柱融合；骨移植替代物Bone marrow stromalderived osteoblastsporous tricalcium phosphate composites as b

3、one graft substitute for posterior thoracic spinal fusionAbstract：ObjectiveTo evaluate the efficacy of autogenous bone marrow stromalderived osteoblastsporous(BMSCs) tricalcium phosphate(TCP) composites as an alternative to autogenous graft materials in spinal fusion.MethodPosterior thoracic spine f

4、usion was carried out in 60 White New Zealand rabbits using one of the following graft materials:TCP granules plus cultured MSCs(group );TCP granules plus fresh autogenous bone marrow(group ); TCP granules  alone(group ); and autogenous bone graft(group ). All the rabbits were killed 12 weeks a

5、fter surgery to evaluate with radiography, CT, manual palpation and  histologic analysis.ResultThe rate of fusion was significantly higher in group compared with group , group and group ; In group I histological analysis showed abundance newly formed bone in contact with the implanted granules;

6、In group there were a reduced amount of newly formed bone and abundant fibrous tissue; In group there were relatively little new bone formation and abundant fibrous tissue; In group , there were thin trabeculae of newly formed bone closed to the decorticated lamina and some fibrous tissue.Conclusion

7、The results indicate that bone marrow stromalderived osteoblast TCP composites may provide an well alternative to autogenous graft materials for spinal fusion.Key words：Bone marrow stromal cell; tricalcium phosphate; Spinal fusion; Bone graft substitutes脊柱融合材料的研制及生物學(xué)因素在脊柱融合的過程中所起的作用已引起廣泛重視，本實驗探討應(yīng)用多孔

8、陶瓷磷酸三鈣（TCP，上海貝奧路生物材料公司）復(fù)合培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行脊柱融合，以期達(dá)到良好的脊柱融合率，尋找更理想的脊柱融合骨移植替代材料。1  材料和方法1.1 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 將穿刺抽取的兔骨髓細(xì)胞液在1h內(nèi)進(jìn)行接種培養(yǎng)。按3×105/cm2的密度接種于DMEM液培養(yǎng)瓶中，于37，5%CO2培養(yǎng)，5d后換液，去除未貼壁細(xì)胞，加入含成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。以后每隔3d換液。細(xì)胞生長達(dá)融合8090后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，計數(shù)。按134進(jìn)行細(xì)胞傳代。收集第三代細(xì)胞備用。1.2 載體

9、（TCP）的準(zhǔn)備將TCP人工骨制備成5mm3大小，用三蒸水在超聲清洗機上反復(fù)清洗，洗凈其表面及孔隙中的碎屑，干燥后環(huán)氧乙烷消毒無菌包裝備用。1.3 組織工程骨的構(gòu)建將TCP人工骨顆粒浸在纖維連接蛋白（100mg/ml）溶液中，4條件下放置16h；然后換成DMEM培養(yǎng)基，并取傳第三代的骨細(xì)胞，以（510）×106/ml的濃度與TCP混合，在37，5%CO2培養(yǎng)條件下用搖床動態(tài)培養(yǎng)24h，其中復(fù)合培養(yǎng)12h換液1次。然后同等條件下改靜態(tài)培養(yǎng)，體外培養(yǎng)35d。制備組織工程化人工骨復(fù)合物。1.4 脊柱融合動物分組和手術(shù)方法1.4.1 動物分組    &

10、#160;  60只兔子分4組進(jìn)行胸椎后路融合：組（組織工程化骨即TCP復(fù)合BMSCs），組（TCP自體紅骨髓），組（單純TCP），組（自體髂骨）。將擬植入的TCP人工骨粒浸在纖維連接蛋白（100mg/ml）溶液中，4條件下放置16h。組：植入TCP復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞。組：植入TCP新鮮自體骨髓(每側(cè)5ml，共10ml/只)。組：植入單純TCP。組：植入自體髂骨皮質(zhì)松質(zhì)骨顆粒。植入材料均為5g。1.4.2 手術(shù)方法       兔耳靜脈苯巴比妥鈉35mg/kg麻醉。剃毛、固定、消毒。胸椎后正中切口，顯露雙側(cè)椎板和關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)；去

11、除椎板小關(guān)節(jié)上軟組織，并將椎板、小關(guān)節(jié)皮質(zhì)骨打毛，刮勺刮去關(guān)節(jié)間隙部分軟骨。每側(cè)放置2.5g植骨材料。逐層縫合。術(shù)后分籠飼養(yǎng)。肌注青霉素80m/d，共57d。1.5脊柱融合的評價方法1.5.1  X線片結(jié)合CT平掃及三維重建評估融合情況       按照Curylo3的分級標(biāo)準(zhǔn)評分, 3、4分時診斷為堅固融合； 2分、2分以下時診斷為假關(guān)節(jié)形成。由2名有經(jīng)驗的醫(yī)生用雙盲法進(jìn)行評估。 1.5.2 非破壞性手工力學(xué)檢測      取出整塊胸椎標(biāo)本，修剪標(biāo)本長度為融合節(jié)段加上下各1

12、個椎體，保留上下各一節(jié)段正常未做融合節(jié)段的目的是做為融合節(jié)段力學(xué)檢測的對比。剔除周圍肌肉組織，去除前方椎體及保留各韌帶后方椎板，關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)、橫突，手工力學(xué)檢測，評價融合情況。1.5.3  組織學(xué)分析       將上述力學(xué)檢測的標(biāo)本用4福爾馬林固定24h，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析用SAS6.12軟件非參數(shù)檢驗做統(tǒng)計學(xué)分析。當(dāng)P0.05時，為有顯著性差異。2 結(jié)果2.1  動物一般情況術(shù)后2d內(nèi)死亡4只,及時補做實驗;其余動物未見不良反應(yīng)。2.2 標(biāo)本大體觀察剔除骨周軟組織，植骨

13、材料周圍未見炎癥現(xiàn)象。組較、組融合骨塊體積大；在、組融合塊的外面可以看到不同程度的陶瓷顆粒嵌于融合塊中，組和組標(biāo)本的陶瓷顆粒與周圍組織粘附較緊密，而組中陶瓷顆粒易于從周圍組織中剝離。2.3 影像學(xué)觀察在X線片和CT平掃及CT三維重建上觀察融合骨塊，有以下特點： 組的骨塊形成量相對較大、植骨與椎板融合界面及質(zhì)地均勻度均好于其它各組(圖14)。按照Curylo3制定客觀分級標(biāo)準(zhǔn),4組之間堅固融合的百分比有顯著性差異（P=0.0324）;組的融合率高于、組(P<0.05）(表1) 。表2 手工觸診力學(xué)檢測融合情況組別 （略）2.4 手工力學(xué)檢測按Boden4的分級標(biāo)準(zhǔn)。組大部分獲得堅固融合；組

14、和組未融合標(biāo)本形成率均接近50，而堅固融合的比率相對低。組未融合比率明顯低于、組（P<0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義；、 3組之間無顯著性差異(表2)。表1 放射學(xué)評分組別 （略）              2.5 組織學(xué)觀察組：整個融合骨塊的陶瓷骨微孔內(nèi)全部充滿新生骨，中央有血管形成，無纖維結(jié)締組織（圖5）。組：融合骨塊的陶瓷骨微孔內(nèi)為新生骨和纖維結(jié)締組織，新生骨的量明顯少于組（圖6）。組：與、組相比，陶瓷骨顆粒微孔內(nèi)多為結(jié)締組織，新生骨的量少，只見少量新生骨貼附于陶瓷骨表

15、面（圖7）。組：12周時，自體骨與椎板達(dá)到愈合，但骨小梁稀疏，沒有再血管化的傾向（圖8）。3 討論自體移植骨能夠為新骨形成提供必要的材料包括骨形成細(xì)胞、生長因子以及支撐骨細(xì)胞和細(xì)胞間基質(zhì)的支架結(jié)構(gòu)。但是自體骨移植尚有某些不足之處，難以普遍推廣應(yīng)用。尋找自體骨替代材料的研究已有多年1,尚無一致的結(jié)論 。一些研究認(rèn)為具有骨傳導(dǎo)作用的材料單獨應(yīng)用于脊柱后外側(cè)融合時不能獲得較高的融合率2。加上具有骨誘導(dǎo)作用的物質(zhì)特別是BMP家族，比單用具有骨傳導(dǎo)作用的材料能獲得明顯高的融合率1。然而，BMP費用昂貴和可能引起異位骨化等副作用限制了其臨床應(yīng)用，況且BMP在臨床試驗性應(yīng)用中沒有獲得比單獨應(yīng)用自體移植骨5或

16、脫鈣骨基質(zhì)更好的融合效果6。但也有動物實驗表明BMSCs+BMP較新鮮紅骨髓有更快、更強的成骨能力7。尋找更好的植骨融合材料是目前骨組織工程研究的熱點。BMSCs有多向分化潛能，在體外一定的誘導(dǎo)條件下可以擴(kuò)增分化為成骨細(xì)胞并分泌細(xì)胞因子；TCP陶瓷骨具有良好的生物相容性、孔隙率和機械性能，且能降解，是骨組織工程的良好載體。本實驗研究表明用TCP復(fù)合培養(yǎng)BMSCs進(jìn)行脊柱融合比單獨應(yīng)用TCP獲得明顯高的堅固融合率，并且有比自體骨融合率更高的趨勢。TCP可能影響放射學(xué)評分，在X線片和CT均表現(xiàn)出有連續(xù)性骨塊，但組織工程化骨組比單純應(yīng)用TCP組似乎更均勻同質(zhì)并且植骨與椎板連接更緊密。這個結(jié)果在大體標(biāo)

17、本上也能證實：單獨應(yīng)用TCP進(jìn)行融合動物的融合塊中，其陶瓷顆粒容易從融合塊周圍組織中剝脫，而應(yīng)用TCP復(fù)合BMSCs或加入新鮮骨髓進(jìn)行融合的融合塊中，其陶瓷顆粒不容易從周圍組織中剝脫。已經(jīng)有很多研究通過長骨缺損的動物模型證實了新鮮骨髓的骨誘導(dǎo)作用, 然而當(dāng)新鮮骨髓被用于脊柱后外側(cè)融合時，其結(jié)果爭議很大1，3。本研究表明，用TCP復(fù)合BMSCs進(jìn)行融合，其融合率比應(yīng)用簡單機械混合新鮮骨髓的TCP融合率高，并且組織學(xué)分析I組中新生骨的量明顯比組多。本實驗研究證實BMSCs經(jīng)過體外刺激分化為骨祖細(xì)胞后可以種植到TCP陶瓷骨上，這種復(fù)合材料在脊柱融合實驗研究中可以促進(jìn)新骨形成，其融合效果明顯好于單純T

18、CP陶瓷骨材料。參考文獻(xiàn)：1Boden S D， Martin G J Jr，Morone M，et al.The use of coralline hydroxyapatite with bone marrow, autogenous bone graft, or osteoinductive bone protein extract for posterolateral lumbar spine fusionJ.Spine,1999,15;24(4):320-327.2Itoh H， Ebara S，Kamimura M，et al. Experimental spinal fusion with use of recombinant human bone morphogenetic protein 2J. Spine,1999，15;24(14):1402-1405.3Curylo LJ,Johnstone B,Petersilge CA,et al.Augmentation of spinal arthrodesis with autologous bone marrow in a rabbit po