化療藥物體外誘導白血病細胞凋亡的研究

1、    化療藥物體外誘導白血病細胞凋亡的研究        【摘要】目的研究化療藥物誘導白血病細胞凋亡的作用及其與Bcl-2表達、臨床預后指標及臨床療效的關系。方法利用形態(tài)學觀察、DNA瓊脂糖凝膠電泳、凋亡指示抗體APO 2.7結合流式細胞儀檢測法，研究臨床治療相關劑量的化療藥物誘導急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞、急性混合性白血病(HAL)細胞的凋亡及其Bcl-2表達率。結果(1)用臨床治療相關劑量的長春新堿(VCR)、地塞米松(Dex)、柔紅霉素(DNR)、阿糖胞苷(Ar

2、a-C)作用2024 h后，多數(shù)患兒（分別為22/24、19/24、6/11、6/6）的白血病細胞可發(fā)生凋亡。但是DNR引起部分患兒（3/11）的白血病細胞發(fā)生壞死。(2)VCR組與Dex組以及Ara-C組與Dex組的誘導凋亡率呈高度正相關，相關系數(shù)分別為0.821(P<0.001)和0.994(P<0.001）。(3)新鮮離體白血病細胞的凋亡率為(3.2±1.9)%。ALL及HAL細胞體外培養(yǎng)24 h后的自發(fā)凋亡為(18.2±13.5)%，且與VCR，Dex及Ara-C的誘導凋亡率呈正相關，相關系數(shù)分別為0.878（P<0.001）、0.893（P<

3、;0.001）、0.882（P<0.05）。(4)CD34是影響白血病細胞凋亡率的獨立指標。陽性組（CD3430%）的VCR、Dex誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率明顯低于陰性組。(5)白血病細胞的Bcl-2表達率與藥物誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率無負相關關系。結論誘導凋亡是臨床治療相關劑量的化療藥物殺傷白血病細胞的重要機制?！娟P鍵詞】脫噬作用；白血??；抗腫瘤藥 Apoptosis of leukemic cells induced by chemotherapeutic drugs in vitroCHENG Jinrong, ZHAO Xinmin, ZHENG Huyong（Beijing Chi

4、ldrens Hospital Affiliated to Capital University of Medical Sciences, Beijing 100045, China）【Abstract】ObjectiveTo study the ability of the chemotherapeutic drugs for inducing apoptosis and its relation to the Bcl-2 expression of leukemic cells, the prognostic factors and the efficacy of clinical tre

5、atment. MethodsThe morphologic study, agarose gel electrophoresis and flow cytometry were utilized to investigate the apoptosis of acute lymphoid leukemia (ALL) and hemoblastocy acute leukmia (HAL) cells induced by vincristine (VCR), dexamethasone (Dex), cytosine arabinoside (Ara-C) and daunorubicin

6、 (DNR) at clinically relevant dosage. The flow cytometry was also used to study the expression of Bcl-2 on leukemic cells.Results(1) Exposure of leukemic cells to clinically relevant concentrations of VCR, Dex, Ara-C and DNR for 2024 hours resulted in apoptosis in most patients (22/24, 19/24, 6/11 a

7、nd 6/6, respectively). Necrosis was found in leukemic cells of some patients (3/11) on DNR treatment. (2)The proportion of apoptotic cells induced by some chemotherapeutic drugs showed positive correlations with each other. The correlation coefficient of apoptotic rate in VCR group and Dex group was

8、 0.821 (P<0.001), in Ara-C group and Dex group was 0.994 (P<0.001). (3)The apoptotic rate of fresh leukemic cells was (3.2±1.9)%. ALL and HAL cells cultured for 24 hours in vitro would develop spontaneous apoptosis in (18.2±13.5)%. The spontaneous apoptosis rate correlated positively

9、 to the apoptosis rates induced by VCR, Dex and Ara-c, the relevant coefficients were 0.878 (P<0.001), 0.893 (P<0.001) and 0.882 (P<0.05), respectively. (4)CD34 was an independent factor influencing apoptotic rates, the apoptotic rate was significantly lower in CD34 positive group (CD3430%)

10、 than that in CD34 negative group. (5)There was no relationship between the expression of Bcl-2 and the apoptic rate of leukemic cells. ConclusionInducing apoptosis is an important mechanism of killing leukemic cells by chemotherapeutic drugs.【Key words】Apoptosis; Leukemial; Antineoplastic agents近年來

11、的研究發(fā)現(xiàn)白血病的發(fā)生和化療藥物導致的白血病細胞死亡，都與細胞凋亡有密切關系。細胞凋亡是基因控制下的細胞主動死亡過程，現(xiàn)已證實幾乎所有化療藥物在體內和體外都能通過細胞凋亡機制殺死白血病細胞1,2。化療藥物的抗癌效果不僅取決于藥物對靶細胞的直接作用，更在于其誘導腫瘤細胞凋亡的能力。我們研究了幾種常用化療藥物在臨床治療相關劑量下對急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞及急性混合性白血病(HAL)細胞的凋亡誘導作用及其與臨床預后因素的關系。對象及方法一、對象1.病例選擇：我院1997年10月1998年3月住院的初治ALL及HAL患兒共24例。男13例，女11例；年齡4個月13歲，平均年齡6歲7個月。根據(jù)F

12、AB標準，24例初治患兒全部為ALL，其中L1型 2例，L2型 18例，L3型 4例。23例初診時進行免疫分型，其中B系19例，T系4例。依據(jù)Catovsky雙表型急性白血病積分法判定其中4例為HAL。2.正常對照：共10例，男5例，女5例；年齡110歲，平均年齡6歲7個月。骨髓取自骨科畸形矯形手術中的切除骨。二、主要試劑1.單克隆抗體: 標記熒光素藻紅蛋白(PE)的APO 2.7及IgG1。純凈的APO 2.7，Bcl-2 (購自Immunotech公司，法國),標記熒光素異硫氰酸熒光素(FITC)的羊抗鼠二抗 (購自Dako公司，丹麥)。2.DNA瓊脂糖凝膠電泳試劑：溶液1含10 mmol

13、/L的Tris-Cl (pH 7.6),10 mmol/L KCl,10 mmol/L 的MgCl2; 溶液2含10 mmol/L Tris-Cl (pH7.6), 10 mmol/L 的KCl,10 mmol/L 的MgCl2, 0.5 mol/L 的NaCl, 0.5%的SDS, 2 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA); 5×TBE ,TE , 分子標記物： DNA/EcoR I+Hind III(北京中山生物技術公司產品)。3.其他：毛地黃皂苷為Sigma產品；BFA膜處理劑含0.02 mol/L 的PBS （pH 7.2）45 ml、甲醛10 ml、丙酮45 ml；

14、淋巴細胞分層液（比重：1.077）。三、方法1.白血病患兒骨髓單個核細胞懸液制備及培養(yǎng)：取肝素抗凝的骨髓液23 ml，用淋巴細胞分層液常規(guī)分離單個核細胞，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液約10 ml調整細胞濃度為3×105/ml，加入用生理鹽水配制的臨床治療相關劑量的化療藥物0.1 ml，使其終濃度分別為長春新堿(VCR) 1.0 g/ml，地塞米松(Dex) 5.0 g/ml,柔紅霉素(DNR) 10 g/ml,阿糖胞苷(Ara-C) 50 g/ml；生理鹽水對照組(自發(fā)凋亡組)加入0.1 ml滅菌生理鹽水(NS),在37，5%CO2孵箱飽和濕度下培養(yǎng)3。2.形態(tài)學方法

15、檢測凋亡：體外培養(yǎng)的白血病細胞經姬姆薩染色和蘇木精染色后油鏡下觀察。3.DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測凋亡：生理鹽水對照組，VCR，Dex，Ara-C組白血病細胞體外培養(yǎng)4044 h和DNR組白血病細胞體外培養(yǎng)2024 h后收集細胞，提取DNA進行瓊脂糖凝膠電泳觀察4。4.用流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例：在體外培養(yǎng)24 h的生理鹽水對照組、VCR、Dex、Ara-C組白血病細胞，新鮮白血病細胞和正常兒童單個核細胞用毛地黃皂苷破膜后以直接法標記凋亡指示抗體APO 2.7，體外培養(yǎng)的DNR組白血病細胞用毛地黃皂苷破膜后以間接法標記凋亡指示抗體APO 2.7(由于DNR有自發(fā)紅熒光)。最后用FACscan

16、流式細胞儀進行數(shù)據(jù)分析5。5.白血病細胞和正常兒童骨髓單個核細胞Bcl-2的表達：在1×106細胞懸液0.1 ml中加入1%多聚甲醛0.5 ml及BFA膜處理劑各0.5 ml，室溫放置5 min后用間接法標記Bcl-2單抗，然后用FACscan流式細胞儀檢測。四、統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)應用SPSS統(tǒng)計軟件進行配對t檢驗，成組t檢驗，方差分析，卡方檢驗，秩和檢驗，相關分析及多元逐步回歸分析。結果一、形態(tài)學表現(xiàn)光鏡下細胞凋亡的形態(tài)學改變主要是染色質凝聚、核固縮斷裂、細胞漿濃縮，但細胞膜保持完整。隨化療藥物種類及作用時間的不同，細胞凋亡的形態(tài)學改變亦不完全相同，并呈階段性改變。用臨床治療相關劑量的

17、VCR、Dex、DNR、Ara-C作用2024 h 后，多數(shù)患兒（分別為 22/24、19/24、6/11、6/6）的白血病細胞可出現(xiàn)細胞凋亡的形態(tài)學改變，主要是早、中期凋亡細胞，而晚期凋亡細胞極少見。但部分患兒（3/11）的白血病細胞加入DNR培養(yǎng)2024 h即出現(xiàn)以細胞壞死為主的表現(xiàn)。二、DNA瓊脂糖凝膠電泳表現(xiàn)用臨床治療相關劑量的不同化療藥物作用于不同患兒的白血病細胞后，在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)“梯狀”條帶(說明發(fā)生細胞凋亡)的時間和清晰度有很大差異。多數(shù)患兒（6/11）的白血病細胞用DNR作用2024 h后，凝膠電泳上可出現(xiàn)“梯狀”條帶，但少部分患兒 （3/11） 的白血病細胞，此時電泳

18、即出現(xiàn)彌漫膜狀條帶（說明發(fā)生細胞壞死）。而應用VCR、Dex、Ara-C作用的白血病細胞約4044 h后才出現(xiàn)典型的“梯狀”條帶，且不如用DNR作用的白血病細胞的條帶清晰。三、凋亡指示抗體APO 2.7檢測細胞凋亡率單克隆抗體APO 2.7(anti-7A6)是一種新型的檢測早期凋亡的指示抗體5。新鮮離體的白血病細胞與正常兒童骨髓單個核細胞的凋亡率均在較低水平，分別為(3.2±1.9)%和(4.3±1.8)%?；熕幬锾幚戆籽〖毎?015 h后，用APO 2.7單抗結合流式細胞儀即可檢測出凋亡，而此時形態(tài)學及DNA瓊脂糖凝膠電泳均不能檢出明顯凋亡。白血病細胞在體外不加入化

19、療藥物培養(yǎng)也能發(fā)生自發(fā)凋亡，其與臨床治療相關劑量的VCR、Dex、Ara-C作用白血病細胞24 h后的誘導凋亡率呈正相關關系(表1）。表1不同化療藥物誘導白血病細胞的凋亡率與其相應的自發(fā)凋亡率的關系化療藥物配對數(shù)細胞凋亡率(±s，%)配對比較P值兩組凋亡率相關系數(shù)r相關性檢驗P值實驗組生理鹽水對照組VCR2430.4±3.918.2±2.80.000*0.8780.000*Dex2430.7±5.118.2±2.80.000*0.8930.000*DNR1129.9±7.014.2±2.80.0570.1060.756Ara

20、-C621.5±6.012.1±2.20.0770.8820.020*注：*差異有極顯著性，* 差異有顯著性；生理鹽水對照組即自發(fā)凋亡組 VCR、Dex、Ara-C三者的凋亡誘導率呈高度正相關。VCR和Dex組（n=24）的相關系數(shù)為0.821 (P<0.001)，Ara-C和Dex組（n=6）的相關系數(shù)為0.994 (P<0.001)。根據(jù)流式細胞儀結合凋亡指示抗體APO 2.7檢測凋亡百分率（APO 2.7表達率）來判斷白血病細胞對藥物誘導凋亡的敏感性（表2），VCR與Dex組的凋亡敏感性也呈高度正相關，相關系數(shù)r為0.846 (P<0.001)。AL

21、L組與HAL組之間對化療藥物VCR及Dex的凋亡誘導率差異無顯著性,P值分別為0.345和0.569。表224例患兒白血病細胞對VCR和Dex誘導凋亡敏感性的對照（例數(shù)）VCR組敏感性Dex組敏感性合計不敏感低度敏感中度敏感高度敏感不敏感22低度敏感3328中度敏感415高度敏感189合計573924注：相關系數(shù)rs為0.846(P<0.001)；高度敏感：凋亡百分率30%；中度敏感：凋亡百分率20%29%；低度敏感：凋亡百分率10%19%；不敏感：凋亡百分率10% 結合細胞形態(tài)學觀察及DNA電泳檢測，發(fā)現(xiàn)治療相關劑量的DNR對白血病細胞的作用機制與VCR、Dex、Ara-C的機制有所不

22、同，11例中6例患兒表現(xiàn)為誘導凋亡為主，3例表現(xiàn)為引起壞死為主，2例無明顯作用。三者的APO 2.7表達率差異有顯著性，平均秩次分別為8.3、3.7和2.5(P=0.035)。三者的錐蟲藍拒染率差異也有顯著性，平均秩次分別為6.8，2.3和9.0(P=0.043)?？梢姛o明顯作用的細胞最高，發(fā)生凋亡為主的細胞次之，發(fā)生壞死為主的細胞最低。四、影響白血病細胞凋亡的因素1.不同臨床預后指標與化療藥物誘導凋亡及自發(fā)凋亡的關系（表3）：CD34陽性組（CD3430%）的VCR、Dex誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率明顯低于陰性組（CD34<30%）。髓系抗原陰性ALL的VCR、Dex誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率

23、高于髓系抗原陽性ALL。肝臟肋緣下5 cm組的VCR、Dex誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率高于無明顯肝臟腫大組。T系白血病的自發(fā)凋亡率高于B系白血病。外周血幼稚細胞0.30組的自發(fā)凋亡率高于外周血幼稚細胞<0.30組。而其他不良預后指標如：年齡>10歲或2歲，病程3個月，淋巴結腫大(直徑2.5 cm)及脾臟腫大（肋下5 cm），外周血高白細胞（WBC25×109/L），骨髓FAB分型為L3型等對藥物誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率均無顯著意義。進一步對上述5項陽性指標進行多元逐步回歸分析，發(fā)現(xiàn)僅有CD34這一個因素對藥物誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率有影響。表3ALL及HAL患兒白血病細胞的藥物誘

24、導凋亡率及自發(fā)凋亡率與不同預后指標的關系(±s，%)影響因素例數(shù)自發(fā)凋亡率均值顯著性檢驗P值VCR誘導凋亡率均值顯著性檢驗P值Des誘導凋亡率均值顯著性檢驗P值CD34陽性(30%)1110±70.005*18±80.001*18±120.026*陰性(<30%)1225±1542±2041±23免疫分型B系1916±120.035*29±210.50525±240.087T系426±537±722±22肝臟肋緣下5cm826±120.044*43&

25、#177;220.017*45±220.039*<5cm1614±1324±1423±21外周血幼稚細胞0.301025±160.022*38±210.10642±250.057<0.301413±825±1622±22髓系抗原陰性ALL1126±1543±2242±24髓系抗原陽性ALL89±320±513±7急性混合性白血病414±1021±1128±36F值0.0220.0120.035P

26、值與0.1140.0820.507與0.006*0.010*0.004*與0.3660.8600.252* 差異有極顯著性，* 差異有顯著性 2.白血病細胞Bcl-2表達率與化療藥物誘導凋亡及自發(fā)凋亡的關系：初診ALL及HAL患兒(n=24)白血病細胞的Bcl-2 表達率明顯高于正常對照組兒童 (n=10) 骨髓的單個核細胞Bcl-2的表達率，平均秩次分別為22.5及5.5 (P<0.001)。但進一步分析發(fā)現(xiàn)白血病細胞的Bcl-2表達率與體外化療藥物VCR、Dex、DNR、Ara-C誘導凋亡率及自發(fā)凋亡率的相關系數(shù)分別為 -0.023(n=24)，0.071(n=24), 0.275

27、(n=11), 0.037 (n=6), -0.033 (n=24),它們之間無明顯負相關關系。討論應用治療相關劑量的VCR、Dex、Ara-C、DNR，均可誘導敏感的ALL或HAL細胞發(fā)生凋亡，說明誘導凋亡是化療藥物殺傷白血病細胞的重要機制。幾種不同藥物的凋亡誘導率呈高度正相關，提示某些化療藥物可能有相似的凋亡誘導途徑。Muller等6發(fā)現(xiàn)以不同濃度的蒽環(huán)類藥物阿霉素作用于急性淋巴細胞白血病細胞系Molt-4細胞，小劑量發(fā)生依賴于RNA合成的凋亡反應，大劑量則不能誘導凋亡，且明顯抑制RNA合成。原癌基因Bcl-2被認為是抑制細胞凋亡的重要基因。但是本試驗發(fā)現(xiàn)ALL及HAL細胞的Bcl-2蛋白

28、表達率與藥物誘導凋亡率及體外自發(fā)凋亡率無明顯負相關關系。Karawajew等7也發(fā)現(xiàn)，ALL中Bcl-2蛋白的表達與其體外培養(yǎng)自發(fā)凋亡率及CD95介導的凋亡無關。說明單靠Bcl-2蛋白并不能抑制所有細胞的凋亡。其活性也受其他一些蛋白，如p53、Raf-1等的調節(jié)。另外Bcl-2基因屬于通過相互作用而調節(jié)細胞凋亡的Bcl-2基因家族，他們之間的比例決定細胞是否發(fā)生凋亡。在各種預后指標中，CD34是一個影響白血病細胞凋亡率的獨立指標。研究發(fā)現(xiàn)多種生長因子受體與CD34抗原共同表達，如蛋白酪氨酸激酶(PTK)家族成員c-kit和flt-3，在CD34陽性細胞的增殖及分化過程中起重要作用，且對化療藥物

29、誘導CD34陽性白血病細胞凋亡有影響8。另外CD34蛋白可能參與跨膜信號傳導，推測CD34分子可能通過影響細胞凋亡的信號傳導途徑而影響凋亡。新鮮離體的白血病細胞的凋亡率很低，但是在體外培養(yǎng)后可產生不同程度的自發(fā)凋亡。骨髓基質細胞可以通過分泌某些抑制凋亡的細胞因子或直接接觸作用來阻止白血病細胞的自發(fā)凋亡。此外，部分白血病細胞自分泌細胞因子的功能對他的高度增殖和凋亡抑制也有重要意義9。另外白血病細胞的體外自發(fā)凋亡率與化療藥物誘導凋亡率呈正相關，這對我們預測臨床療效，指導治療起重要作用。我們發(fā)現(xiàn)白血病細胞對凋亡誘導的敏感性與臨床療效有關。1例T-ALL患兒的白血病細胞對VCR，Dex誘導凋亡均為高度

30、敏感，給予VP(長春新堿、潑尼松)方案預處理的第2天外周血白細胞立即由260×109/L（幼稚細胞100%）降至2×109/L。部分患兒的白血病細胞對Dex誘導凋亡不敏感，臨床單用潑尼松治療后骨髓白血病細胞比例無明顯降低。大部分ALL及HAL患兒的白血病細胞對Ara-C誘導的細胞凋亡不敏感，但1例嬰兒白血病患兒對Ara-C誘導的細胞凋亡表現(xiàn)高度敏感。Barnedo等10曾報道以Ara-C等抗代謝藥為基礎的化療方案成功地使2例復發(fā)的白血病嬰兒再次獲得緩解且長期存活。不同患兒的白血病細胞對不同化療藥物的敏感性差異很大，我們在臨床化療前進行細胞凋亡等藥物敏感性試驗將有助于個體化治

31、療，可進一步提高白血病的治療效果。（本文編輯：滕淑英）作者單位：成金蓉(100045首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院)趙新民(100045首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院)鄭胡鏞(100045首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院)趙衛(wèi)紅(軍事醫(yī)學科學院)參考文獻1，Hirt A, Leibundgut K, Annette RL, et al. Cell birth and death in childhood acute lymphoblastic leukemia: how fast does the neoplastic cell clone expand? Br J Hematol,1997, 98: 999-1001.2，Hickman JA. Apoptosis induced by anticancer drugs. Cancer Metast Rev, 1992,11: 121-139.3，張魯榕,孔憲濤,謝映華,等.白血病化療藥物體外敏感試驗的臨床應用.中華血液學雜志,1990,11:141-142.4，盧圣棟,主編.現(xiàn)代分子生物學實驗技術.北京:高等教育出版社,1993.209-211.5，Zhang CH, Ao ZH, Seth A, et al. A mitochondrial membrane protein defined by a novel monocl