人參多糖對(duì)HCG誘導(dǎo)黃體與顆粒細(xì)胞功能的影響

1、               作者：孫艷，馮立 ，王洪軍，年春志，禇征，王立強(qiáng) ，張志強(qiáng)，吳益民【摘要】  目的研究人參多糖對(duì)大鼠卵巢功能的作用。方法采用體外細(xì)胞培養(yǎng)觀(guān)察人參多糖對(duì)HCG誘導(dǎo)的黃體與顆粒細(xì)胞分泌孕酮與cAMP的影響，并檢測(cè)了卵母細(xì)胞的存活率。分離培養(yǎng)黃體、顆粒與卵母細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組與不同濃度人參多糖實(shí)驗(yàn)組，采用放免分析方法測(cè)定孕酮與cAMP生成含量，細(xì)胞存活率檢測(cè)采用MTT法。結(jié)果與對(duì)照組比較，孕酮含量：黃體細(xì)胞為（6 573.46

2、±185.14）與(4509.55±126.82)pmol，顆粒細(xì)胞為（197.16±42.87）與(320.42±12.46)pmol。cAMP：黃體細(xì)胞為（31.20±17.13）與(65.26±15.93)fmol，顆粒細(xì)胞為(121.15±19.96)與(296.42±27.28)fmol。結(jié)論 人參多糖抑制HCG誘導(dǎo)黃體細(xì)胞孕酮分泌，促進(jìn)HCG誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞孕酮分泌。而協(xié)同黃體細(xì)胞與顆粒細(xì)胞cAMP生成，人參多糖使卵母細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率降低，呈區(qū)間劑量依賴(lài)關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  人參多糖； 孕酮； 環(huán)腺

3、苷酸； 人絨毛膜促性腺激素The Effect of Ginseng Polysugar on Secretion Function of Luteal and Granulose Cell of Rat in vitroAbstract：ObjectiveTo study  using of ginseng polysugar on secretion function of female rat ovary. The experiment had observed progesterone and cAMP by HCG inducing luteal and granulose

4、 cell as well as living cell rate of oocyte in vitro.MethodsRat luteal and granulose cell and oocyte was cultivated, cell counting was worked by microscope, progesterone and cAMP content was determined by radioimmunoassay kit(RIA kit). Cell exist rate of oocyte was determined by MTT way. ResultsProg

5、esterone: the luteal cell test groups compare with control group, 6573.46±185.14 and（4509.55±126.82）pmol.The granulose cell test groups compare with control group, 197.16±42.87 and (320.42±12.46)pmol.cAMP: the luteal cell test groups compare with control group, 31.20±17.13an

6、d(65.26±15.93)fmol，the granulose cell test groups compare with control group, 121.15±19.96 and (296.42±27.28)fmol.ConclusionThis treatise had demonstrated that ginseng polysugar can inhibit HCG inducing progesterone secretion and enhancing cAMP content of luteal and granulose cell of

7、rat, ginseng polysugar has lower oocytes cell grow up inhibitory rate. It is evident that ginseng polysugar possesses characteristic of dose dependent.Key words：Ginseng polysugar;  Progesterone;  cAMP;   HCG     許多研究表明人參多糖具有補(bǔ)養(yǎng)元?dú)?、增?qiáng)性腺機(jī)能的作用1，其通過(guò)影響下丘腦垂體性腺軸分泌系統(tǒng)后，靶器官組織則

8、通過(guò)細(xì)胞內(nèi)cAMP信息傳遞系統(tǒng)啟動(dòng)一系列生理生化反應(yīng)，卵巢作為下丘腦-垂體-性腺軸作用的生殖系統(tǒng)，其受到人參多糖的作用，加速性成熟過(guò)程，生殖周期的功能也會(huì)發(fā)生不同的變化。人參多糖對(duì)生殖細(xì)胞的影響比較復(fù)雜，尚缺乏全面系統(tǒng)的詳細(xì)報(bào)道，為探討人參多糖對(duì)人絨毛膜促性腺激素（HCG）誘導(dǎo)的大鼠黃體與顆粒細(xì)胞分泌功能，本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀(guān)察了人參多糖對(duì)HCG誘導(dǎo)的大鼠卵巢黃體與顆粒細(xì)胞分泌孕酮與cAMP的含量變化，并檢測(cè)了細(xì)胞存活率。本研究?jī)?nèi)容未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1  材料1.1  動(dòng)物與細(xì)胞體重為250300 g左右成年健康雌性大鼠，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心

9、，在本實(shí)驗(yàn)室分籠飼養(yǎng)，顆粒飼料，自動(dòng)飲水，適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。黃體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞取自大鼠卵巢。1.2  試劑與儀器MoCoy's 5a培養(yǎng)基干粉、膠原酶、孕酮、人絨毛膜促性腺激素、肝素購(gòu)自Sigma公司；小牛血清購(gòu)自上海生物工程公司；孕馬血清購(gòu)自天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心；人參多糖由吉林大學(xué)化學(xué)教研室惠贈(zèng)（2 g/L）；3H-孕酮購(gòu)自上海生物制品研究所；125I-cAMP放免藥盒購(gòu)自上海中醫(yī)學(xué)院，二甲苯、PPO，POPOP，HCI，NaOH等購(gòu)自沈陽(yáng)化學(xué)試劑公司，均為分析純；CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Shel-Lab公司，型號(hào)1815TC；超凈工作臺(tái)：江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，型

10、號(hào)SW-CJ-2FD；倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司，型號(hào)CX21FS1。低溫離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司，型號(hào)J2-21；液閃儀：瑞典LKB公司（機(jī)效50%），型號(hào)LKB1211；Kontro -計(jì)數(shù)儀：瑞士公司，型號(hào)Kontro-28D。2  方法2.1  細(xì)胞培養(yǎng)2.1.1  黃體細(xì)胞的制備與培養(yǎng)將雌性大鼠頸部皮下注射孕馬血清50U/只，48 h后皮下注射人絨毛膜促性腺激素45U/只，1周后，動(dòng)物斷頭處死，無(wú)菌取卵巢，將黃體化卵巢剪碎，0.2%膠原酶5 ml消化，置37培養(yǎng)箱，每15 min吸管吹打，1 h后，加入5 ml MoCoy's

11、5a培養(yǎng)液，混勻，200 r/min，離心2 min。棄沉淀，1300 r/min，離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液10 ml，1 300 r/min，離心10 min，洗2次。加新培養(yǎng)液，混勻，取50 l，再加50 l 0.4%臺(tái)盼藍(lán)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活細(xì)胞百分率。用5%胎牛血清MoCoy's 5a培養(yǎng)液調(diào)至30萬(wàn)細(xì)胞/0.5 ml，加入人參多糖（30 ng/ml），接種24孔培養(yǎng)板，5%CO2，95%通氣，37培養(yǎng)24 h，0.5 ml無(wú)血清MoCoy's 5a培養(yǎng)液洗1次，加含有人參多糖0.91 ml無(wú)血清培養(yǎng)液，24 h后，換液，洗1次。加無(wú)血清培養(yǎng)液1 m

12、l，設(shè)對(duì)照組與人參多糖實(shí)驗(yàn)組，將含有人參多糖的培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液，煮沸5 min，-20存放，用于孕酮與cAMP放免測(cè)定。2.1.2  顆粒細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 將雌性大鼠腹部皮下注射去氫已烯雌酚油劑0.5 mg/0.1 ml/只，連續(xù)注射4 d，第5天后，動(dòng)物斷頭處死，無(wú)菌取卵巢，將用去氫已烯雌酚油劑處理的大鼠卵巢用小號(hào)針頭（41/2）刺破卵泡，釋放出顆粒細(xì)胞。離心，收細(xì)胞，加適量培養(yǎng)液，取50 l，加50 l 0.4%臺(tái)盼藍(lán)，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)與活細(xì)胞百分率?；罴?xì)胞一般在40%60%之間。按活細(xì)胞數(shù)用5%胎牛血清MoCoy's 5a培養(yǎng)液調(diào)至30萬(wàn)細(xì)胞/0.5 ml,

13、 加入人參多糖，接種24孔培養(yǎng)板24 h，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗1次，設(shè)37對(duì)照組與人參多糖實(shí)驗(yàn)組，將含有人參多糖的培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液，煮沸5 min，-20存放，用于孕酮、cAMP的放免測(cè)定。2.1.3  卵母細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 將雌性大鼠頸部皮下注射孕馬血清，25U/只，刺激卵泡發(fā)育，48 h后，將動(dòng)物斷頭處死，腹部用75%酒精消毒，在超凈臺(tái)內(nèi)取下卵巢，將用孕馬血清處理48 h的卵巢，在解剖鏡下盡可能分成含有幾個(gè)卵泡的小塊，用針頭刺破卵泡，釋放到含有100 l/ml氨茶堿的培養(yǎng)液中，離心即可收集卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞收集在24孔培養(yǎng)板中，加入人參多糖培養(yǎng)8 10 h。之后加

14、入含0.2%透明質(zhì)酸酶、1%檸檬酸鈉與10 mmol/L EDTA培養(yǎng)液，設(shè)37對(duì)照組與人參多糖實(shí)驗(yàn)組，在相差鏡計(jì)數(shù)卵母細(xì)胞的存活率。2.2  甾體激素與第二信使含量的測(cè)定2.2.1  孕酮的放免測(cè)定具體操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，樣品制備參考文獻(xiàn)2。2.2.2  cAMP的放免測(cè)定具體操作過(guò)程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.3  細(xì)胞存活率的MTT實(shí)驗(yàn)取傳代培養(yǎng)黃體與顆粒細(xì)胞，胰酶消化后計(jì)數(shù)，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)得活細(xì)胞數(shù)為90%以上，接種于滅菌96孔培養(yǎng)板中，每孔為1×104。實(shí)驗(yàn)組加入不同劑量人參多糖，對(duì)照組加PBS溶液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。各孔用培養(yǎng)液補(bǔ)

15、足至終體積為200 l。置37，5%CO2 孵箱內(nèi)孵育24 h后，加入噻唑藍(lán)PBS溶液（5 g/L），每孔20 l，37反應(yīng)4 h后，吸棄培養(yǎng)液及未反應(yīng)的噻唑藍(lán)，每孔加入 DMSO溶液100 l，振蕩后室溫下靜止10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定吸收光（A值），計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。-     The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of longan necleuses. It has a bri

16、lliant prospect in developing this natural resources. 【參考文獻(xiàn)】  1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production technology question and answ

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