大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外可誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞

1、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外可誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞    作者：姜廷帥蔡莉惠延年閆峰 AbstractAIM: To explore the plasticity of transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSC) into corneal epithelial cells. METHODS: MSC of adult rats that were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with an a

2、ttachment culture method. The transdifferentiation of MSC into corneal epithelial cells were induced in vitro by co-cultured with corneal stromal fibroblasts. The expression of K12 on MSCs which is expressed specially in corneal epithelial cells was identified by immunofluorescent staining. RESULTS:

3、 MSC cultured in vitro showed great potential of proliferation. CD29 was positive, and CD34, CD45 were negative in cultured cells, indicating that the cultured cells were MSC. After co-cultured with corneal stromal fibroblasts for one week, MSC expressed K12, indicating that they had been transdiffe

4、rentiated into corneal epithelial cells. CONCLUSION: The data suggests that MSC have the potential to transdifferentiate into corneal epithelial cells in vitro.    ? KEYWORDS: mesenchymal stem cell; corneal epithelial cells; transdifferentiation    摘要目的:探討骨髓間充

5、質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）分化為角膜上皮細(xì)胞的可塑性及其重建角膜上皮的可能性。方法:用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠骨髓MSC，經(jīng)體外與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，免疫熒光法檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞特異標(biāo)志物K12的表達(dá)。 結(jié)果:體外培養(yǎng)的大鼠骨髓MSC表現(xiàn)出很強(qiáng)的增殖潛能，原代培養(yǎng)的骨髓MSC CD29免疫熒光染色陽(yáng)性，CD34和CD45為陰性，符合骨髓MSC的特征。MSC與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)1wk后大部分細(xì)胞分化為間質(zhì)細(xì)胞，少部分細(xì)胞形態(tài)上相對(duì)偏小，免疫熒光檢測(cè)這部分細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志角蛋白K12。 結(jié)論:體外培養(yǎng)的MSC在角膜基質(zhì)細(xì)胞的誘

6、導(dǎo)下可橫向分化為角膜上皮細(xì)胞。    關(guān)鍵詞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；角膜上皮；細(xì)胞分化    0引言    角膜上皮再生的來(lái)源是角膜緣干細(xì)胞，角膜緣干細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的眼表異常。采用自體或同種異體角膜緣移植，可一定程度的重建眼表，但因供體來(lái)源不足及異體移植引起的排斥反應(yīng)而受限；而單純羊膜移植重建眼表，因無(wú)上皮再生來(lái)源的干細(xì)胞而不能治療角膜緣嚴(yán)重受損的眼表?yè)p傷。組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一問(wèn)題帶來(lái)了希望。成年人骨髓中存在著多向潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem

7、 cell，MSC），在體外不同條件下可以定向地被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨、軟骨、肌腱及骨髓基質(zhì)等不同細(xì)胞。我們對(duì)骨髓MSC向角膜上皮細(xì)胞的分化潛能做一些初步的探索，從而探討骨髓MSC作為構(gòu)建組織工程化角膜的種子細(xì)胞的可行性。    1材料和方法    1.1材料 PBS液(含青鏈霉素100kU/L)；細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM/Hams F12 ,10 mL/L胎牛血清)；2.5g/L胰蛋白酶；中性蛋白酶dispase；Percoll儲(chǔ)存液（密度1077g/L）；兔抗大鼠CD29，

8、CD34，CD45mAb（美國(guó)Chemicon公司）、兔抗大鼠角蛋白K12mAb（美國(guó)Santa Cruz公司），山羊抗兔FITC標(biāo)記二抗（北京中山生物技術(shù)公司），跨室培養(yǎng)裝置（Transwell，孔徑0. 45m，美國(guó)Millipore公司）。    1.2方法    1.2.1大鼠骨髓MSC的分離培養(yǎng) 取4wk齡SD大白鼠，雌雄不限，斷頸處死后于750mL/L乙醇中浸泡10min。無(wú)菌條件下用外科剪于大鼠的股骨端將大腿剪下，剪去脛骨，用眼科剪剪開(kāi)皮膚，分離去除肌肉，剪去股骨兩端的膨隆部分，暴露骨髓腔，用含肝素的

9、PBS液沖洗骨髓腔，收集于培養(yǎng)皿，如此反復(fù)數(shù)次。在一無(wú)菌離心管中，加入Percoll液0.6mL和8.5g/L NaCl溶液0.4mL，混勻配制成密度為1 077g/L的細(xì)胞密度梯度分離液。將收集的細(xì)胞懸液緩慢加在分離液的上部，2 000r/min離心30min，去除上清。PBS洗2次，按2×108/L密度接種細(xì)胞于75mL塑料培養(yǎng)瓶中。接種48h后換液，以后每23d換液，觀察細(xì)胞增殖能力及形態(tài)學(xué)特征（倒置顯微鏡）。另將原代培養(yǎng)的MSC接種于蓋玻片上，待細(xì)胞長(zhǎng)出后，用PBS離心洗滌 （1 000r/min，5min）2次，把細(xì)胞片浸入950mL/L乙醇中固定。將已經(jīng)固定的細(xì)胞玻片放入

10、蓋片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。滴加滴度為13264的特異性抗體(一抗，CD29，CD34，CD45，K12)，置于濕盒內(nèi)，37保溫孵育60min，另以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。隨后PBS振洗3次，吹干。滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體（二抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG），置于濕盒內(nèi)，37保溫30min。PBS振洗2次，然后用蒸餾水振洗1次。500mL/L緩沖甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。    1.2.2角膜基質(zhì)細(xì)胞的制備 無(wú)菌條件下摘取大鼠眼球，沿角膜緣處分離出整個(gè)角膜，先用普通消化液浸泡，置于3730min ，再用dispase

11、于37消化23h 。消化后用PBS 洗去消化下來(lái)的上皮細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞未消化干凈，用眼科小鑷子輕輕刮取細(xì)胞，確保角膜上皮細(xì)胞完全被消化下來(lái)。將角膜基質(zhì)剪成1mm×1mm大小的組織塊，放入離心管中加入4mL膠原酶，將離心管傾斜放入37孵箱內(nèi)，每隔5min振搖一次，消化1h。收集消化液，過(guò)100目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾，800r/min離心，5min，去除上清，用PBS離心漂洗12次，去除上清，按1×107/L密度接種于25mL培養(yǎng)瓶中。    1.2.3大鼠骨髓MSC與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng) 按Millipore公司的說(shuō)明，用Tran

12、swell共培養(yǎng)體系（跨室培養(yǎng)器，孔徑0.45m）裝置進(jìn)行大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與角膜基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)。共培養(yǎng)體系中上、下層的細(xì)胞被隔開(kāi)，培養(yǎng)液和可溶性因子可以自由通過(guò)，細(xì)胞無(wú)法通過(guò)。在6孔培養(yǎng)板中以1×108/L的密度接種第2代MSC，其中3個(gè)孔放置Transwell小室作為誘導(dǎo)組，另外3個(gè)孔不放置Transwell小室作為對(duì)照組。在Transwell小室中接種大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞（第2代），滴加40g/L表皮生長(zhǎng)因子（EGF），共培養(yǎng)7d后，間接免疫熒光法檢測(cè)抗角膜上皮細(xì)胞特異性角蛋白K12在與角膜緣基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)（方法同前）。  

13、0; 2結(jié)果    2.1 MSC生長(zhǎng)特征 培養(yǎng)3d細(xì)胞開(kāi)始伸展，換液去除未貼壁細(xì)胞可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)的MSC數(shù)量較少，散在分布，體積較大，呈紡錘形或梭形。7d后開(kāi)始出現(xiàn)較大的克隆，貼壁細(xì)胞迅速增殖，為成纖維細(xì)胞樣，胞質(zhì)豐富，核大，貼壁牢，不易消化(圖1)。14d后細(xì)胞融合，呈漩渦狀排列(圖2)。培養(yǎng)的大鼠原代MSC表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD29（圖3），不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34，CD45，角蛋白K12染色陰性，符合骨髓MSC特征。    2.2角膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)特征 培養(yǎng)2d可見(jiàn)細(xì)胞伸展，呈梭形或不規(guī)則三角形。

14、細(xì)胞核為橢圓形位于中央，細(xì)胞質(zhì)向外伸展突起。3d后，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，呈放射狀排列生長(zhǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)7d，細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)(圖4)。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，約5d左右融合。將第2代的細(xì)胞用于共培養(yǎng)體系。    2.3 MSC共培養(yǎng)后特征 誘導(dǎo)組MSC經(jīng)7d的共培養(yǎng)誘導(dǎo)，大部分細(xì)胞體積變大，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞質(zhì)比例明顯增大，分化為間質(zhì)細(xì)胞，小部分細(xì)胞形態(tài)上相對(duì)偏小，細(xì)胞核明顯，散在分布(圖5)。免疫熒光檢測(cè)這部分細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志角蛋白K12，周圍未染色細(xì)胞為分化為間質(zhì)的細(xì)胞(圖6)。對(duì)照組MSC細(xì)胞體積變大，細(xì)胞進(jìn)一步融合呈漩渦狀排列（圖7）。免疫

15、熒光染色檢測(cè)不表達(dá)角蛋白K12（圖8）。    圖1 體外培養(yǎng)的大鼠原代骨髓MSC，呈成纖維細(xì)胞樣，紡錘形或梭形（7d×200）    圖2 融合后的大鼠原代MSC，呈漩渦狀排列（14d×100）    圖3 體外培養(yǎng)MSC CD29表達(dá)陽(yáng)性（IF×100）    圖4 體外培養(yǎng)的大鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞（7d×100）    圖5 共培養(yǎng)誘導(dǎo)后的MSC（7d

16、15;200）    圖6 共培養(yǎng)誘導(dǎo)后的MSC K12陽(yáng)性（IF×100）    圖7 對(duì)照組未誘導(dǎo)的MSC（7d×100）    圖8 對(duì)照組未誘導(dǎo)MSC K12陰性（IF×100）    3討論    眼表由角膜上皮、結(jié)膜上皮和淚膜3部分組成，眼表的穩(wěn)定對(duì)維持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮細(xì)胞再生的來(lái)源是角膜緣干細(xì)胞，干細(xì)胞缺失會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的眼表異

17、常，進(jìn)而造成角膜混濁，危害視力。目前，對(duì)這類疾病尚無(wú)理想的治療方法。 臨床采用自體角膜緣干細(xì)胞移植對(duì)部分患者有良好療效，但是，當(dāng)雙眼均發(fā)生大面積眼表?yè)p害時(shí)，健康角膜緣干細(xì)胞的來(lái)源受限1,2。近年研究發(fā)現(xiàn)，成年人骨髓中存在著具有多向分化潛能的 MSC3，在體外不同條件下可以定向地被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨、軟骨、肌腱及骨髓基質(zhì)等不同細(xì)胞4-6 。這類細(xì)胞來(lái)源確切、充足，取材方便，分化潛能大，避免了胚胎干細(xì)胞可能面臨的倫理學(xué)問(wèn)題，并且因?yàn)槭亲泽w組織，所以不存在排斥反應(yīng)，可能具有更加良好的應(yīng)用前景。研究表明，角膜基質(zhì)是角膜上皮細(xì)胞和角膜緣干細(xì)胞的微環(huán)境，具有維持

18、角膜上皮細(xì)胞特性的作用，特別是角膜緣基質(zhì)維持角膜緣干細(xì)胞特性的作用是肯定的7。角膜緣基質(zhì)含有多種自分泌和旁分泌細(xì)胞因子及其受體，共同組成了角膜緣基質(zhì)層復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)控微環(huán)境，維持角膜緣干細(xì)胞的正常分化、繁殖和不進(jìn)入終極分化，在角膜緣永存。以往國(guó)內(nèi)外研究多采用角膜緣干細(xì)胞作為眼表重建組織工程的種子細(xì)胞，雖然角膜緣干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的研究已得到相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展,但其部位的局限性以及材料的難獲得性限制了進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在為角膜的組織工程尋找更多更好的種子細(xì)胞，尤其是當(dāng)眼表嚴(yán)重?fù)p傷，角膜緣細(xì)胞完全或大部分喪失不能修復(fù)眼表，用骨髓MSC替代角膜緣細(xì)胞進(jìn)行移植具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。利用角膜基質(zhì)細(xì)胞模擬

19、角膜緣干細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境與MSC在Transwell體系中共培養(yǎng)，誘導(dǎo)MSC向角膜上皮細(xì)胞分化，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。角膜基質(zhì)具有誘導(dǎo)非角膜細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化的能力8，運(yùn)用Transwell共培養(yǎng)體系能較好的模擬體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境，上下層細(xì)胞不發(fā)生直接接觸，0.45m孔徑的聚碳脂膜可以保證細(xì)胞因子正常通過(guò)而細(xì)胞不會(huì)通過(guò)，因此不會(huì)發(fā)生細(xì)胞間的污染?；|(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及外源性細(xì)胞因子（EGF）共同組成了MSC分化所需的復(fù)雜細(xì)胞因子調(diào)控微環(huán)境，促進(jìn)MSC向角膜上皮分化。共培養(yǎng)后的細(xì)胞可以表達(dá)角膜上皮特異性角蛋白K12，說(shuō)明在特定的條件下，MSC可以向角膜上皮定向分化。我們利用組織工程技術(shù)體外培養(yǎng)MSC

20、，與角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)MSC向角膜上皮轉(zhuǎn)化，體外重建角膜上皮組織, 為進(jìn)一步行組織工程化角膜上皮層移植奠定了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為角膜組織工程中種子細(xì)胞的來(lái)源開(kāi)辟了一個(gè)新的途徑，然而其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。 【參考文獻(xiàn)】 1 Dua HS, Azuara Blanco A. Autologous limbal transplantation in patients with unilateral corneal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol ,2000;84:27322782 Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med ,2000;343:862933 Pittenger MF. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science,1998;284:143214