生物技術(shù)常用技術(shù)(1)-PCR技術(shù)及應(yīng)用

1、 Kary Mullis 19933PCRAgarose gel electrophoresisUV 檢測檢測3-4 hours夾心雜交夾心雜交模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer對樣品不合適對樣品不合適引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解解反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時間太短伸時間太短 原原因因?qū)Σ卟呒兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛〖兓０寤蛘呤褂迷噭┖刑崛∧０迥０錎NADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更換更換BufferBuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級

2、結(jié)構(gòu)）或者換一體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物管新引物降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照正對照(marker?)(marker?)有條帶，而樣品則無有條帶，而樣品則無； 非特異性擴增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：PCRPCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶?；蛐?，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)Σ卟咧匦略O(shè)計引

3、物或者使用巢重新設(shè)計引物或者使用巢式式PCRPCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴增 拖尾(與非特異性擴增條帶明顯不同，非特異性擴增帶有明顯的條帶分隔。) 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)狀態(tài)。 M 1 2模板不純模板不純BufferBuffer不合適不合適退火溫度偏低退火溫度偏低酶量過多酶量過多dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)Σ卟呒兓０寮兓０甯鼡Q

4、更換BufferBuffer適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度適量用酶適量用酶適當(dāng)降低適當(dāng)降低dNTPdNTP和鎂離子的和鎂離子的濃度濃度減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況) ) 原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染打開標(biāo)本管蓋時樣品飛濺，造成樣品間相互污染。打開標(biāo)本管蓋時樣品飛濺，造成樣品間相互污染。使用帶有污染的試劑。使用帶有污染的試劑。公用試劑如液體石蠟等污染。公用試劑如液體石蠟等污染。操作時手套引起的交叉污染。操作時手套引起的交叉污染。加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常帶有加樣器通道易形成氣溶膠，氣溶膠常

5、帶有PCRPCR產(chǎn)物污產(chǎn)物污染，可用有濾篩的吸頭避免此類污染。染，可用有濾篩的吸頭避免此類污染。實驗室污染。實驗室污染。 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 對策： PCRPCR前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。前后工序分室操作，試劑器材分室存放低溫貯存。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，凡耐高溫的試劑器材均除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，凡耐高溫的試劑器材均高壓滅菌。高壓滅菌。TipTip頭、頭、EppendorfEppendorf管等最好一次性使用。管等最好一次性使用。操作人員必須戴手套進行操作。操作人員必須戴手套進行操作。試劑小量分裝保存，用前先離心，操作時應(yīng)小心輕柔，試

6、劑小量分裝保存，用前先離心，操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外防止開蓋防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外防止開蓋時液體濺出。時液體濺出。（2）逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR（reverse transcription-PCR）逆轉(zhuǎn)錄酶：逆轉(zhuǎn)錄酶：AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為42）和）和MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為逆轉(zhuǎn)錄酶（最適溫度為37）逆轉(zhuǎn)錄引物：逆轉(zhuǎn)錄引物：隨機引物；隨機引物；Oligo(dT)；特異；特異性引物。性引物。one-step RT-PCR：在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄引物、逆轉(zhuǎn)錄引物、Taq DNA聚合酶、

7、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和緩沖液，直接以和緩沖液，直接以mRNA 為模板進行逆轉(zhuǎn)錄和為模板進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增，稱為一步法擴增，稱為一步法RT-PCR。基本原理：基本原理：抽提細胞總抽提細胞總RNA或或mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成作用下合成cDNA，通過，通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶在末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA 3端加上端加上poly(dG)尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物尾。據(jù)此設(shè)計錨定引物poly(dC)，為提高擴增特異性，為提高擴增特異性，poly(dC)在十二聚以上，錨定在十二聚以上，錨定引物引物5端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的序列信息。根據(jù)已知的3端序列設(shè)計基因特異性引端序列設(shè)計基因特異性引物，與錨定引物一起進行物，與錨定引物一起進行PCR擴增。擴增。用途：用途：檢測檢測T細胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。細胞受體和免疫球蛋白基因的多態(tài)性。反向反向PCR已知序