流式細(xì)胞儀分析技術(shù)-副本

1、流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是是2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代發(fā)展起來(lái)的一種以流式細(xì)胞儀為年代發(fā)展起來(lái)的一種以流式細(xì)胞儀為工具，能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，工具，能快速測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)，如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNADNA、RNARNA、蛋白質(zhì)、抗、蛋白質(zhì)、抗原等，并可對(duì)其分類、收集的高新技術(shù)。原等，并可對(duì)其分類、收集的高新技術(shù)。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（FCMFCM）借鑒了熒光顯微鏡）借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)技術(shù), , 同時(shí)利用計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、電同時(shí)利用計(jì)算機(jī)技術(shù)

2、、激光技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等多門高新技術(shù)的發(fā)展等多門高新技術(shù)的發(fā)展, , 將熒光顯微鏡的激將熒光顯微鏡的激發(fā)光源改為激光發(fā)光源改為激光, , 使之具有更好的單色性與使之具有更好的單色性與激發(fā)效率激發(fā)效率, , 因而大大提高了檢測(cè)靈敏度因而大大提高了檢測(cè)靈敏度, , 同同時(shí)將固定的標(biāo)本臺(tái)改為流動(dòng)的單細(xì)胞懸液時(shí)將固定的標(biāo)本臺(tái)改為流動(dòng)的單細(xì)胞懸液, , 用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, , 從而大大提高了檢從而大大提高了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)精確性, , 而且從同一個(gè)細(xì)胞中而且從同一個(gè)細(xì)胞中可以同時(shí)測(cè)得多項(xiàng)參數(shù)可以同

3、時(shí)測(cè)得多項(xiàng)參數(shù), , 被譽(yù)為是細(xì)胞分析被譽(yù)為是細(xì)胞分析領(lǐng)域的領(lǐng)域的“CTCT”。 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（FCMFCM）以其快速、靈活、）以其快速、靈活、大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于大量、靈敏和定量的特色，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐各個(gè)方面，包括細(xì)基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐各個(gè)方面，包括細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等，在各藥理學(xué)、遺傳學(xué)及臨床檢驗(yàn)學(xué)等，在各學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。學(xué)科領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。 該儀器具有高度的精密性，測(cè)定的該儀器具有高度的精密性，測(cè)定的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。既可分析單個(gè)細(xì)胞，也數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。既可分析單個(gè)

4、細(xì)胞，也能區(qū)分群體細(xì)胞，檢測(cè)的速度可達(dá)能區(qū)分群體細(xì)胞，檢測(cè)的速度可達(dá)50005000個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞/ /秒，分選純度可高達(dá)秒，分選純度可高達(dá)99%99%以上。以上。 由于該儀器的由于該儀器的多參數(shù)性、準(zhǔn)確多參數(shù)性、準(zhǔn)確性、性、快速快速性及分選的高純度性等特點(diǎn)，所以性及分選的高純度性等特點(diǎn)，所以在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病理在細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病理學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到越來(lái)越廣泛學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。的應(yīng)用。 細(xì)胞組成細(xì)胞組成細(xì)胞功能細(xì)胞功能大小大小細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細(xì)胞活性細(xì)胞活性DNA, RNADNA, R

5、NA含量含量胞內(nèi)細(xì)胞因子胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性流式細(xì)胞儀常檢測(cè)的細(xì)胞特性 經(jīng)熒光色素染色的細(xì)胞或包裹在鞘液里的經(jīng)熒光色素染色的細(xì)胞或包裹在鞘液里的其他生物微粒，從其他生物微粒，從5050100m100m的噴嘴逐個(gè)高速的噴嘴逐個(gè)高速噴出，通過(guò)一個(gè)聚焦的光源，進(jìn)而通過(guò)各種光噴出，通過(guò)一個(gè)聚焦的光源，進(jìn)而通過(guò)各種光敏元件測(cè)量這些細(xì)胞或微粒所發(fā)射的散射光以敏元件測(cè)量這些細(xì)胞或微粒所發(fā)射的散射光以及熒光，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析和處理可得到多種信息及熒光，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析和處理可得到多種信息參數(shù)。

6、參數(shù)。一、工作原理一、工作原理 單細(xì)胞液柱已標(biāo)記的單細(xì)胞懸液和鞘液硅化管流動(dòng)室噴嘴熒光檢測(cè)系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號(hào)熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號(hào)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)分析結(jié)果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過(guò)程基本過(guò)程結(jié)構(gòu)示意圖結(jié)構(gòu)示意圖 （1 1） 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) （2 2） 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) （3 3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測(cè)細(xì)胞待測(cè)細(xì)胞 單個(gè)細(xì)胞的懸液?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的熒光染料標(biāo)記的單抗對(duì)其染色單抗對(duì)其染色 受清潔氣體壓力受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)從樣品管進(jìn)入流動(dòng)室形成樣本流入流動(dòng)

7、室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是鞘液：輔助樣本流被正常檢測(cè)的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。（1）液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)噴嘴噴嘴FluorescenceFluorescencesignalssignalsFocused laserFocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系統(tǒng)示意圖液流系統(tǒng)示意圖FCMFCM的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個(gè)細(xì)胞流）何形成單個(gè)細(xì)胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管液流系統(tǒng) 液流系統(tǒng)將樣本懸

8、液聚焦在光源的中心處Sample Flow in Optical CuvetteSampleLaminarFlowLow Flow Rate12 m mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOptical CuvetteHigh Sample Flow Rate60 m mL/min 高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)高流速適用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)。 低流速

9、促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過(guò)，這樣低流速促使樣本流變窄，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過(guò)，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)量比較均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如驗(yàn)，如DNA 分析。分析。 為確保粒子和細(xì)胞完全通過(guò)激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力為確保粒子和細(xì)胞完全通過(guò)激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力對(duì)實(shí)驗(yàn)操作是至關(guān)重要的。對(duì)實(shí)驗(yàn)操作是至關(guān)重要的。 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長(zhǎng)分色反光鏡：反射長(zhǎng)/ /短波長(zhǎng)，通過(guò)短短波長(zhǎng)，通過(guò)短/ /長(zhǎng)長(zhǎng)

10、波長(zhǎng)波長(zhǎng) 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通濾片：長(zhǎng)通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3, FL4（熒光）（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)）光學(xué)系統(tǒng)FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光學(xué)系統(tǒng)示意圖光學(xué)系統(tǒng)示意圖Optical Filters460 50

11、0 540460 500 540460 500 540LongpassShortpassBandpass主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)細(xì)胞在液柱中與激光束相交時(shí)向周圍向周圍360立體角方向散射的光線立體角方向散射的光線信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形信號(hào)，它的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為為前向散射光前向散射光和側(cè)向散射光側(cè)向散射光。二、散射光的測(cè)定二、散射光的測(cè)定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, FSFS）：激

12、光束照射細(xì)胞時(shí)，光激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以相對(duì)軸較小角度以相對(duì)軸較小角度(0.5(0.51010) )向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)向前方散射的訊號(hào)用于檢測(cè)細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。胞等粒子的表面屬性，信號(hào)強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比。FALS SensorLaser前向散射光示意圖前向散射光示意圖側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（side scatter, SSside scatter, SS）：）：激光束照射細(xì)激光束照射細(xì)胞時(shí)，光以胞時(shí)，光以9090角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞角散射的訊號(hào)，用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。結(jié)構(gòu)屬性。FALS Sensor90LS SensorLaser側(cè)

13、向散射光側(cè)向散射光示意圖示意圖 測(cè)得的測(cè)得的FSFS與與SSSS信信號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，號(hào)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理，可得到可得到FS-SSFS-SS圖，由圖，由此可僅用散射光信號(hào)此可僅用散射光信號(hào)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)對(duì)未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。光散射測(cè)量最有效用途：光散射測(cè)量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激熒光信號(hào)由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)不同。發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長(zhǎng)與

14、激發(fā)光波長(zhǎng)不同。 每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)每種熒光染料會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色，通過(guò)波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒波長(zhǎng)選擇通透性濾片，可將不同波長(zhǎng)的散射光和熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。光信號(hào)區(qū)分開(kāi)，送入不同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的選擇不同的單抗及染料就可同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上的多個(gè)不同特征。多個(gè)不同特征。 線性放大器和對(duì)數(shù)放大器線性放大器和對(duì)數(shù)放大器三、熒光測(cè)量三、熒光測(cè)量熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(EXCITING)(EXCITING)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(EMISSION)(EMISSION)Opt

15、icsLaserLaserFluorochromesFluorochromesDetector Detector ParameterParameterFilterFilter熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償流式細(xì)胞術(shù)補(bǔ)償調(diào)節(jié)流式細(xì)胞術(shù)補(bǔ)償調(diào)節(jié)9條準(zhǔn)則：條準(zhǔn)則：1、用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臉?biāo)本必須單染。、用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臉?biāo)本必須單染。2、樣本必須可染出一群陽(yáng)性和一群陰性，以比較它們、樣本必須可染出一群陽(yáng)性和一群陰性，以比較它們之間的平均熒光強(qiáng)度。之間的平均熒光強(qiáng)度。3、可以使用同一熒光的另一抗體替換目的抗體來(lái)調(diào)節(jié)、可以使用同一熒光的另一抗體替換目的抗體來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償（例如在稀有細(xì)胞檢測(cè)時(shí)）。補(bǔ)償（例如在稀有細(xì)胞檢測(cè)時(shí)）。4、使

16、用表達(dá)強(qiáng)度高的抗體來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償。、使用表達(dá)強(qiáng)度高的抗體來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償。5、用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)目贵w必須與實(shí)驗(yàn)用的抗體熒光素一、用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)目贵w必須與實(shí)驗(yàn)用的抗體熒光素一樣（例如不能用樣（例如不能用FITC調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)GFP的補(bǔ)償）。的補(bǔ)償）。6、串聯(lián)染料的抗體如果批號(hào)不同，需要再次做補(bǔ)償。、串聯(lián)染料的抗體如果批號(hào)不同，需要再次做補(bǔ)償。7、陰性和陽(yáng)性細(xì)胞的自發(fā)熒光水平必須一致。、陰性和陽(yáng)性細(xì)胞的自發(fā)熒光水平必須一致。8、補(bǔ)償微球可以代替細(xì)胞（不過(guò)允許做微調(diào)）。、補(bǔ)償微球可以代替細(xì)胞（不過(guò)允許做微調(diào)）。9、千萬(wàn)不要做不設(shè)置補(bǔ)償?shù)膶?shí)驗(yàn)。、千萬(wàn)不要做不設(shè)置補(bǔ)償?shù)膶?shí)驗(yàn)。 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)

17、胞分選主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需主要是在對(duì)具有某種特征的細(xì)胞需進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。進(jìn)一步培養(yǎng)和研究時(shí)進(jìn)行的。四、細(xì)胞分選原理四、細(xì)胞分選原理細(xì)胞懸液形成液流柱細(xì)胞懸液形成液流柱流動(dòng)室振動(dòng)流動(dòng)室振動(dòng)液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴含細(xì)胞的液滴棄去棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)機(jī)械振動(dòng)不充電不充電充電充電（一）分選基本原理（一）分選基本原理 分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液分選速度：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。中細(xì)胞的含量成正比。 分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的分選純度：分選出的目的細(xì)

18、胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。百分率。 分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)分選收獲率：實(shí)際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過(guò)測(cè)量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。量點(diǎn)的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。 分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實(shí)際得率。與分選速度成反比。與分選速度成反比。（二）分選的技術(shù)要求（二）分選的技術(shù)要求 參數(shù)：參數(shù)：FS,SS,FLFS,SS,FL 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙、雙參數(shù)散點(diǎn)圖參數(shù)散點(diǎn)圖 、二維等高圖、二維等

19、高圖 、假三維、假三維等高圖等高圖 、三參數(shù)散點(diǎn)圖、三參數(shù)散點(diǎn)圖 ） 設(shè)門分析技術(shù)設(shè)門分析技術(shù) 第二部分第二部分 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析FSFS：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小SSSS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FLFL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、一、 參數(shù)參數(shù) 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖: :點(diǎn)圖點(diǎn)圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析多參數(shù)分析直方圖直方圖設(shè)門分析設(shè)門分析: :REGION和和GATE設(shè)置設(shè)置二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式 由

20、一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計(jì)數(shù)與顆粒計(jì)數(shù)(COUNT)構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光構(gòu)成，反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細(xì)胞相對(duì)數(shù)量細(xì)胞相對(duì)數(shù)量信道信道(channel(channel ) ) 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測(cè)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)量細(xì)胞的兩個(gè)測(cè)量參數(shù)，根據(jù)這兩個(gè)參數(shù)就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。就可以確定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號(hào)雙參數(shù)信號(hào)通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的通常采用對(duì)數(shù)信號(hào)，最常用的

21、是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，是點(diǎn)密圖，在圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光點(diǎn)圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。強(qiáng)度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖綠色熒光強(qiáng)度綠色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度紅色熒光強(qiáng)度雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖雙參數(shù)直方圖點(diǎn)圖2. 二維等高圖二維等高圖 由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。雙參數(shù)直方圖。 等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高等高”。 曲

22、線層次越高曲線層次越高( (越里面的線越里面的線) ) 所代表的細(xì)胞所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。數(shù)愈多。 等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。等高線越密集則表示細(xì)胞數(shù)變化率越大。二維等高圖二維等高圖3. 假三維等高圖假三維等高圖（三）三參數(shù)直方圖（三）三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。號(hào)可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析（四）流式細(xì)胞儀的多參數(shù)分析 Gate Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根

23、據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求其中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設(shè)門分析技術(shù)三、設(shè)門分析技術(shù)A A 淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞B B 單核細(xì)胞單核細(xì)胞C C 中性粒細(xì)胞中性粒細(xì)胞A A、B B、C C均均為任意門為任意門線性門線性門 Region設(shè)置設(shè)置: 區(qū)閾（區(qū)閾（region, R）

24、與門）與門(gate, G ) 是兩個(gè)是兩個(gè)相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對(duì)應(yīng)，但是也可以包含于門?？梢园陂T。D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時(shí)，起如十字門分析時(shí)，起就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)就可以由四個(gè)區(qū)域構(gòu)成，即成，即G=D1+D2+D3+D4。 樣本制備樣本制備 標(biāo)記染色標(biāo)記染色 液相芯片技術(shù)液相芯片技術(shù) 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 第三部分第三部分 流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求求 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備分離單個(gè)核細(xì)胞分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的樣品

25、制備培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備 蛋白酶消化蛋白酶消化 機(jī)械吹打機(jī)械吹打 使貼壁細(xì)胞脫落使貼壁細(xì)胞脫落 洗滌洗滌 尼龍網(wǎng)過(guò)濾尼龍網(wǎng)過(guò)濾單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞懸液一、免疫檢測(cè)樣品制備一、免疫檢測(cè)樣品制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備新鮮實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備 機(jī)械法機(jī)械法 酶處理法酶處理法 化學(xué)試劑處理法化學(xué)試劑處理法 表面活性劑處理法表面活性劑處理法單細(xì)胞懸液的保存單細(xì)胞懸液的保存 深低溫保存法（一年）深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周） 甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）適用條件適用條件: : 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)

26、對(duì)對(duì)488nm488nm的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收的激發(fā)光波長(zhǎng)有較強(qiáng)的吸收 發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差發(fā)射光波長(zhǎng)與激發(fā)光波長(zhǎng)間有較大的波長(zhǎng)差 易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色二、常用的熒光染料與標(biāo)記染色FITCFITCTexas redTexas redPE.PC.APCPE.PC.APCPEcy5PEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光細(xì)細(xì)胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料藻膽蛋白類藻膽蛋白類（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料（一）幾種常見(jiàn)的熒光染料名稱名稱染料染料激發(fā)激發(fā)

27、波長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對(duì)對(duì)PHPH敏感敏感性性特點(diǎn)特點(diǎn)異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素FITCFITC488488綠綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結(jié)易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅Texas Texas redred568568紅紅 615615不易不易不敏感不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白PEPE488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488別藻青蛋白別藻青蛋白APCAPC633633紅紅670670能量

28、傳遞復(fù)能量傳遞復(fù)合染料合染料PEcy5PEcy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在結(jié)合在一起，在488nm488nm激發(fā)光照射下，通過(guò)激發(fā)光照射下，通過(guò)一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再一個(gè)熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，從而檢測(cè)到該特定熒光信號(hào)。測(cè)到該特定熒光信號(hào)。能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料PECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷花青苷5

29、 5藻紅蛋白藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制能量傳遞復(fù)合染料機(jī)制熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合嵌入結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合共價(jià)鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo)直標(biāo): :干擾少干擾少, ,但需購(gòu)買多種單抗但需購(gòu)買多種單抗間標(biāo)間標(biāo): :步驟多步驟多, ,干擾多干擾多, ,不需標(biāo)記多種抗體不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記組合標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記（二）免疫熒光標(biāo)記 免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)免疫膠乳顆粒的應(yīng)用即液相芯片技術(shù)是把微小是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把的乳膠微球分別染成上百種

30、不同的熒光色，把針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待測(cè)針對(duì)不同檢測(cè)物的乳膠微球混合后再加入待測(cè)標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)標(biāo)本，在懸液中與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合，經(jīng)激光照射后不同待測(cè)物產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)激光照射后不同待測(cè)物產(chǎn)生不同顏色，并可進(jìn)行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有行定量分析。因檢測(cè)速度極快，所以又有“液液相芯片相芯片”之稱之稱 。三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用三、免疫膠乳顆粒技術(shù)的應(yīng)用微小的乳膠微球分別染成上百微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給用探針在芯片上的坐標(biāo)位置給基因的特異性編碼；而液相芯基因的

31、特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來(lái)編碼）片則是用顏色來(lái)編碼）通過(guò)對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)通過(guò)對(duì)標(biāo)記不同熒光素分子的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)FCMFCM對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析對(duì)可溶性物質(zhì)的定量分析 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞竭m當(dāng)?shù)闹苽浞绞?處理紅細(xì)胞處理紅細(xì)胞 實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法實(shí)體組織來(lái)源標(biāo)本用機(jī)械法 溫度溫度25253737，pH7.0pH7.07.27.2四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制四、流式細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)的質(zhì)量控制（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控（一）單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控 溫度溫度 pHpH 染料濃度染料濃度 固定劑固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控（二）免疫熒光染色的質(zhì)控 光路與流路校正光路與流路校正:

32、: 確保激光光路與樣品確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（流處于正交狀態(tài)，減少變異（CVCV）。）。 PMTPMT（光電倍增管）校準(zhǔn)（光電倍增管）校準(zhǔn): : 保證樣品檢測(cè)保證樣品檢測(cè)時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。時(shí)儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。 絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn)絕對(duì)計(jì)數(shù)校準(zhǔn): : 保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。（三）儀器操作的質(zhì)控（三）儀器操作的質(zhì)控 同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，同型對(duì)照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對(duì)照，選用相同源性的選用相同源性的未標(biāo)記單抗未標(biāo)記單抗作為對(duì)照調(diào)整和作為對(duì)照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。設(shè)置電壓，以保證特異性。 全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢

33、測(cè)，全程質(zhì)量控制：與待測(cè)標(biāo)本一起標(biāo)記和檢測(cè)，結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。結(jié)果達(dá)靶值，提示本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控（四）免疫檢測(cè)的質(zhì)控 流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)流式細(xì)胞術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式基礎(chǔ)研究和逐步進(jìn)入臨床應(yīng)用各方面，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的抗原成分進(jìn)行標(biāo)記分析，可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增可區(qū)別多種細(xì)胞的特性，為細(xì)胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。加了有效的手段和幫助。 第四部分第四部分 流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢驗(yàn)流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用中的應(yīng)用T T淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細(xì)胞及其亞群分析淋巴細(xì)胞及其亞群分析B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生產(chǎn)生IgM型自身抗體型自身抗體, 參與免疫調(diào)節(jié)、與自參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關(guān)身免疫病的發(fā)生有關(guān)B2(CD19+CD5-):受外來(lái)抗原刺激受外來(lái)抗原刺激, 產(chǎn)生高親和性特異性抗體產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細(xì)胞分析細(xì)胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋