第一章抗原抗體反應(yīng)

1、第一章第一章 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)診斷技術(shù)概述免疫學(xué)診斷技術(shù)概述(4(4學(xué)時(shí)學(xué)時(shí)) )檢測抗原制備技術(shù)檢測抗原制備技術(shù) 第一節(jié)第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)的原理第二節(jié)第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)第三節(jié)第三節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素第四節(jié)第四節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型第一節(jié)第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體反應(yīng)，主要是指抗原和抗體在抗原抗體反應(yīng)，主要是指抗原和抗體在體體外結(jié)合外結(jié)合所表現(xiàn)的反應(yīng)。由于抗體主要存在所表現(xiàn)的反應(yīng)。由于抗體主要存在于血清中，并且臨床上多用血清做試驗(yàn)，于血清中，并且臨床上多用血

2、清做試驗(yàn)，所以體外實(shí)驗(yàn)中的抗原抗體反應(yīng)曾稱作所以體外實(shí)驗(yàn)中的抗原抗體反應(yīng)曾稱作血血清學(xué)反應(yīng)清學(xué)反應(yīng)（serological reaction)serological reaction)。但。但是隨著免疫學(xué)的發(fā)展，血清學(xué)的含義已不是隨著免疫學(xué)的發(fā)展，血清學(xué)的含義已不能概括目前的研究內(nèi)容，現(xiàn)在多以抗原抗能概括目前的研究內(nèi)容，現(xiàn)在多以抗原抗體反應(yīng)代替血清學(xué)反應(yīng)一詞。體反應(yīng)代替血清學(xué)反應(yīng)一詞。 Ag:Antigen Ab:Antibody Ag:Antigen Ab:Antibody第一節(jié)第一節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng): :指抗原與相應(yīng)抗體之間所指抗原與相應(yīng)抗體

3、之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。 物質(zhì)基礎(chǔ)物質(zhì)基礎(chǔ): : 抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合 抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合面的結(jié)合 抗原抗體之間的結(jié)合力抗原抗體之間的結(jié)合力 親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體靜電引力靜電引力（electrostatic forces）范德華引力范德華引力:作用最小作用最?。╲an der Waals interactions）氫鍵氫鍵:最具特異性最具特異性（hydrogen bond ）疏水作用力疏水作用力:作用最大作用最大 （hydrophobic inte

4、ractions） 抗原抗體結(jié)合力示意圖抗原抗體結(jié)合力示意圖一、抗原抗體結(jié)合力一、抗原抗體結(jié)合力l. l. 靜電引力靜電引力 抗原和抗體分子帶有相反電荷的抗原和抗體分子帶有相反電荷的氨基和羧氨基和羧基基團(tuán)基基團(tuán)之間相互的引力，稱為靜電引力，之間相互的引力，稱為靜電引力，又稱庫倫引力。又稱庫倫引力。例如，抗體分子上帶電荷的堿性氨基酸的例如，抗體分子上帶電荷的堿性氨基酸的游離氨基游離氨基(-NH(-NH3+3+) )和酸性氨基酸的游離羧基和酸性氨基酸的游離羧基(-COO(-COO- -) )可與抗原分子上帶相反電荷的對(duì)應(yīng)可與抗原分子上帶相反電荷的對(duì)應(yīng)基團(tuán)相互吸引。這種基團(tuán)相互吸引。這種引力的大小與

5、兩個(gè)相引力的大小與兩個(gè)相互作用基團(tuán)間的距離平方成反比?；プ饔没鶊F(tuán)間的距離平方成反比。2.2.范德華引力范德華引力 抗原和抗體相互接近時(shí)，由于抗原和抗體相互接近時(shí)，由于分子的極分子的極化作用化作用而出現(xiàn)的引力，稱范德華引力。而出現(xiàn)的引力，稱范德華引力。結(jié)合力的大小與兩個(gè)相互作用基團(tuán)的極化結(jié)合力的大小與兩個(gè)相互作用基團(tuán)的極化程度的乘積成正比、與它們之間距離的程度的乘積成正比、與它們之間距離的 7 7 次方成反比，鍵能約為次方成反比，鍵能約為4.2-12.5kJ/moL4.2-12.5kJ/moL。這種引力的能量小于靜電引力。這種引力的能量小于靜電引力。 3.3.氫鍵結(jié)合力氫鍵結(jié)合力 供氫體上的氫原

6、子與受氫體原子間的引供氫體上的氫原子與受氫體原子間的引力力。在抗原抗體反應(yīng)中，羧基、氨基和。在抗原抗體反應(yīng)中，羧基、氨基和羥基是主要供氫體，而羧基氧、羧基碳羥基是主要供氫體，而羧基氧、羧基碳和肽鍵氧等原子是主要受氫體。和肽鍵氧等原子是主要受氫體。氫鍵結(jié)合力與供氫體和受氫體之間距離氫鍵結(jié)合力與供氫體和受氫體之間距離的的6 6次方成反比，鍵能約次方成反比，鍵能約20.9kJ/mol20.9kJ/mol。 4.4.疏水作用力疏水作用力 兩個(gè)疏水基團(tuán)在水溶液中相互接觸時(shí)，由兩個(gè)疏水基團(tuán)在水溶液中相互接觸時(shí)，由于對(duì)水分子排斥而趨向聚集的力于對(duì)水分子排斥而趨向聚集的力稱為疏水稱為疏水作用力，或稱為疏水鍵。

7、作用力，或稱為疏水鍵。當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時(shí)，抗原決定簇與抗體上當(dāng)抗原抗體反應(yīng)時(shí)，抗原決定簇與抗體上的結(jié)合點(diǎn)靠近，互相間正、負(fù)極性消失，的結(jié)合點(diǎn)靠近，互相間正、負(fù)極性消失，由靜電作用形成的親水層立即失去，從而由靜電作用形成的親水層立即失去，從而促進(jìn)抗原與抗體的相互吸引而結(jié)合。疏水促進(jìn)抗原與抗體的相互吸引而結(jié)合。疏水作用力在抗原抗體反應(yīng)中的結(jié)合是很重要作用力在抗原抗體反應(yīng)中的結(jié)合是很重要的。的。提供的作用力最大，約占總結(jié)合力的提供的作用力最大，約占總結(jié)合力的50%50%。抗體分子上一個(gè)抗抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原決定簇之間相抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著的引適應(yīng)而存在著的引力，

8、是力，是抗原抗體間抗原抗體間固有的結(jié)合力固有的結(jié)合力親和力親和力( (affinity)抗原抗體親和力示意圖抗原抗體親和力示意圖二、抗原抗體的親和力和親合力二、抗原抗體的親和力和親合力抗體結(jié)合部位抗體結(jié)合部位與抗原表位之與抗原表位之間間結(jié)合的強(qiáng)度結(jié)合的強(qiáng)度親合力親合力( (avidity)抗原抗體親合力示意圖抗原抗體親合力示意圖抗體與抗原結(jié)合是可逆的反應(yīng)，在平衡時(shí)其抗體與抗原結(jié)合是可逆的反應(yīng)，在平衡時(shí)其 親和常數(shù)親和常數(shù) K= K= 抗原抗體復(fù)合物濃度抗原抗體復(fù)合物濃度 游離抗原濃度游離抗原濃度游離抗體濃度游離抗體濃度K K代表抗體結(jié)合抗原的親和力代表抗體結(jié)合抗原的親和力。 K K值大的抗體與

9、抗原牢固結(jié)合，不易解離，值大的抗體與抗原牢固結(jié)合，不易解離，稱該抗體有高親和力。稱該抗體有高親和力。三、三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗體和大多數(shù)抗原同屬蛋白質(zhì)。在通常的抗體和大多數(shù)抗原同屬蛋白質(zhì)。在通常的血清學(xué)反應(yīng)條件下均帶有負(fù)電荷，使極化血清學(xué)反應(yīng)條件下均帶有負(fù)電荷，使極化的水分子在其周圍形成的水分子在其周圍形成水化層水化層，成為，成為親水親水膠體膠體，因此蛋白質(zhì)不會(huì)自行凝集出現(xiàn)沉淀。，因此蛋白質(zhì)不會(huì)自行凝集出現(xiàn)沉淀。當(dāng)當(dāng)AgAg與與AbAb結(jié)合后，表面電荷減少，水化層結(jié)合后，表面電荷減少，水化層變??；而且由于變薄；而且由于Ag-AbAg-Ab復(fù)合物形成后，與水復(fù)合物形成

10、后，與水接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為接觸的表面積減少，由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏疏水膠體水膠體。此時(shí)在電解質(zhì)。此時(shí)在電解質(zhì)( (如如NaCl)NaCl)的作用下，的作用下，使各疏水膠體之間進(jìn)一步靠攏、沉淀，形使各疏水膠體之間進(jìn)一步靠攏、沉淀，形成可見的成可見的Ag-AbAg-Ab復(fù)合物。復(fù)合物。 可見反應(yīng)可見反應(yīng)抗原抗體復(fù)合物抗原抗體復(fù)合物 ( (疏水膠體疏水膠體) )電解質(zhì)電解質(zhì) 抗原抗原( (親水膠體親水膠體) ) 抗體抗體( (親水膠體親水膠體) ) + +三、三、親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體第二節(jié)第二節(jié) 抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性特異性 可逆性可逆性比例性

11、比例性 階段性階段性特異性：特異性：抗原與抗體抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖抗原抗體反應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ): :抗原表位與抗抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性構(gòu)型的互補(bǔ)性一、特異性一、特異性兩種不同的抗原兩種不同的抗原分子具有部分相分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)清發(fā)生反應(yīng)交叉反應(yīng)交叉反應(yīng)（cross reactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖二、可逆性二、可逆性可逆性：可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在抗原與相應(yīng)抗

12、體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性 影響因素：影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離合越牢固，越不易解離 環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pHpH、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度 v Ag與與Ab的結(jié)合常需適當(dāng)比例才出現(xiàn)可見反的結(jié)合常需適當(dāng)比例才出現(xiàn)可見反應(yīng)，在最適比例時(shí)反應(yīng)最明顯；應(yīng)，在最適比例時(shí)反應(yīng)最明顯；v 這種現(xiàn)象可以用這種現(xiàn)象可以用“格子學(xué)說格子學(xué)說”來解釋：來解釋：Ab(IgG)為二價(jià)，為二價(jià)，Ag通常為多價(jià)，只有通常為多價(jià)，只有Ag，Ab結(jié)合形成大的

13、復(fù)合物，肉眼才可見。結(jié)合形成大的復(fù)合物，肉眼才可見。三、比例性三、比例性格子學(xué)說格子學(xué)說Myoglobin：肌紅蛋白肌紅蛋白 只有當(dāng)只有當(dāng)Ag與與Ab比例適當(dāng)時(shí)，才能形成大的比例適當(dāng)時(shí)，才能形成大的復(fù)合物，比例不適當(dāng)，就只能形成小的復(fù)合復(fù)合物，比例不適當(dāng)，就只能形成小的復(fù)合物而抑制反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，此所謂物而抑制反應(yīng)現(xiàn)象的出現(xiàn)，此所謂帶現(xiàn)象帶現(xiàn)象； 前帶現(xiàn)象前帶現(xiàn)象：AbAb過剩，過剩，AgAg過少；過少； 稀釋稀釋AbAb，凝集反應(yīng)常見；，凝集反應(yīng)常見； 后帶現(xiàn)象后帶現(xiàn)象：AgAg過剩，過剩，AbAb過少；過少； 稀釋稀釋AgAg、沉淀反應(yīng)常見。、沉淀反應(yīng)常見。前帶現(xiàn)象前帶現(xiàn)象后帶現(xiàn)象后帶現(xiàn)象

14、前帶前帶(prezone)：抗體過量：抗體過量后帶后帶(postzone)：抗原過量：抗原過量等價(jià)帶等價(jià)帶(equivalence zone)(equivalence zone)： 抗原抗體比例合適抗原抗體比例合適 抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性：比例性：抗原與抗體抗原與抗體發(fā)生可見反應(yīng)需遵循發(fā)生可見反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系一定的量比關(guān)系三、比例性三、比例性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見 第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、第二階段：反應(yīng)可見階段，反應(yīng)慢，出現(xiàn)凝集、 沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象 四、階

15、段性四、階段性第三節(jié)第三節(jié) 影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素抗原、抗體反應(yīng)物的自身因素環(huán)境因素環(huán)境因素一、反應(yīng)物自身因素一、反應(yīng)物自身因素抗原抗原: :理化性狀、表位種類和數(shù)目理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體抗體: :來源、特異性、親和性、效價(jià)來源、特異性、親和性、效價(jià)1 1、抗原、抗原 抗原的理化性狀、抗原決定簇的數(shù)目和種抗原的理化性狀、抗原決定簇的數(shù)目和種類均可影響血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果類均可影響血清學(xué)反應(yīng)結(jié)果 例如，可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)沉例如，可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)沉淀，而顆粒性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)則出現(xiàn)凝淀，而顆粒性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)則出現(xiàn)凝集；單

16、價(jià)抗原與抗體結(jié)合不出現(xiàn)可見反應(yīng)；集；單價(jià)抗原與抗體結(jié)合不出現(xiàn)可見反應(yīng)；粗糙型細(xì)菌在生理鹽水中易出現(xiàn)自凝；紅細(xì)粗糙型細(xì)菌在生理鹽水中易出現(xiàn)自凝；紅細(xì)胞與胞與IgGIgG類抗體結(jié)合不出現(xiàn)直接凝集等。類抗體結(jié)合不出現(xiàn)直接凝集等。 一、反應(yīng)物自身因素一、反應(yīng)物自身因素 抗體對(duì)反應(yīng)的影響表現(xiàn)在以下三個(gè)方面抗體對(duì)反應(yīng)的影響表現(xiàn)在以下三個(gè)方面: : (1) (1)來源來源: :來自不同動(dòng)物的免疫血清，其反來自不同動(dòng)物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動(dòng)物的免疫血清具有較寬的等價(jià)帶，通常在抗原過量時(shí)清具有較寬的等價(jià)帶，通常在抗原過量時(shí)才易出現(xiàn)可溶性免疫復(fù)合物；馬等大動(dòng)

17、物才易出現(xiàn)可溶性免疫復(fù)合物；馬等大動(dòng)物和人的免疫血清等價(jià)帶較窄，少量的抗原和人的免疫血清等價(jià)帶較窄，少量的抗原或抗體過剩，均可形成可溶性免疫復(fù)合物或抗體過剩，均可形成可溶性免疫復(fù)合物；家禽免疫血清不能結(jié)合哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體；家禽免疫血清不能結(jié)合哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體，并且在高鹽濃度（，并且在高鹽濃度（8.5% NaCl8.5% NaCl）溶液中）溶液中沉淀現(xiàn)象明顯。沉淀現(xiàn)象明顯。單克隆抗體一般不適用于單克隆抗體一般不適用于沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)。2 2、抗體、抗體(2)(2)特異性與親和力特異性與親和力: : 特異性和親和力是影響血清學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)特異性和親和力是影響血清學(xué)反應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵因素，

18、它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確程度。程度。 免疫動(dòng)物早期獲得的抗血清特異性較好，免疫動(dòng)物早期獲得的抗血清特異性較好，但親和力低；后期獲得的抗血清一般親和但親和力低；后期獲得的抗血清一般親和力較高，但長期免疫易使免疫血清中抗體力較高，但長期免疫易使免疫血清中抗體的類型和反應(yīng)性變得更為復(fù)雜。的類型和反應(yīng)性變得更為復(fù)雜。 因此，因此，用于診斷的試劑必須盡量選用特異用于診斷的試劑必須盡量選用特異性高、親和力強(qiáng)的抗體性高、親和力強(qiáng)的抗體，才能保證和提高，才能保證和提高試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。 （3 3）濃度）濃度: :抗體的濃度往往是與抗原相對(duì)而言。合抗體的濃

19、度往往是與抗原相對(duì)而言。合適的濃度才出現(xiàn)明顯的反應(yīng)現(xiàn)象。因此適的濃度才出現(xiàn)明顯的反應(yīng)現(xiàn)象。因此許多試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行抗體預(yù)滴定，找出最適許多試驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行抗體預(yù)滴定，找出最適反應(yīng)濃度。反應(yīng)濃度。 l.l.電解質(zhì)電解質(zhì) 抗原抗體結(jié)合后由親水性變?yōu)槭杷?，此時(shí)抗原抗體結(jié)合后由親水性變?yōu)槭杷?，此時(shí)易受電解質(zhì)影響，如有適當(dāng)濃度電解質(zhì)存在，易受電解質(zhì)影響，如有適當(dāng)濃度電解質(zhì)存在，就會(huì)使抗原抗體失去一部分電荷而相互凝集或就會(huì)使抗原抗體失去一部分電荷而相互凝集或沉淀，出現(xiàn)可見反應(yīng)沉淀，出現(xiàn)可見反應(yīng); ;若無電解質(zhì)存在，則不若無電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。通常在血清學(xué)試驗(yàn)中，以出現(xiàn)可見反應(yīng)。通常在血清學(xué)試驗(yàn)中，以8.

20、5% 8.5% NaClNaCl溶液作為抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液，其溶液作為抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液，其中中NaNa+ +和和ClCl- -可分別中和膠體顆粒上的電荷，使可分別中和膠體顆粒上的電荷，使膠體顆粒的電勢下降，形成可見的沉淀物或凝膠體顆粒的電勢下降，形成可見的沉淀物或凝集物。但如果電解質(zhì)濃度過高，則會(huì)出現(xiàn)非特集物。但如果電解質(zhì)濃度過高，則會(huì)出現(xiàn)非特異性蛋白質(zhì)沉淀，即鹽析異性蛋白質(zhì)沉淀，即鹽析。二、環(huán)境因素二、環(huán)境因素2.2.酸堿度酸堿度 合適的合適的pHpH是抗原抗體反應(yīng)的必要條件之是抗原抗體反應(yīng)的必要條件之一。血清學(xué)試驗(yàn)一般以一。血清學(xué)試驗(yàn)一般以pH6-9pH6-9為宜，超出為宜，

21、超出此范圍可影響抗原和抗體的理化性質(zhì)，此范圍可影響抗原和抗體的理化性質(zhì)，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。當(dāng)導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。當(dāng)pHpH為為3 3左右左右時(shí)，接近細(xì)菌抗原的等電點(diǎn)，可出現(xiàn)非時(shí)，接近細(xì)菌抗原的等電點(diǎn)，可出現(xiàn)非特異性酸凝集，造成假象。特異性酸凝集，造成假象。 3.3.溫度溫度抗原抗體反應(yīng)一般在抗原抗體反應(yīng)一般在15-4015-40范圍內(nèi)均可進(jìn)范圍內(nèi)均可進(jìn)行，最適溫度為行，最適溫度為3737。在此范圍內(nèi)溫度越。在此范圍內(nèi)溫度越高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，增加抗原抗體接高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，增加抗原抗體接觸機(jī)會(huì)，反應(yīng)速度越快，但亦容易引起復(fù)觸機(jī)會(huì)，反應(yīng)速度越快，但亦容易引起復(fù)合物解離合物解離;

22、;溫度越低，反應(yīng)速度緩慢，但溫度越低，反應(yīng)速度緩慢，但抗原抗體結(jié)合牢固，易于觀察。某些特殊抗原抗體結(jié)合牢固，易于觀察。某些特殊的抗原抗體反應(yīng)需要特定的溫度，如冷凝的抗原抗體反應(yīng)需要特定的溫度，如冷凝集素在集素在44時(shí)與紅細(xì)胞結(jié)合，時(shí)與紅細(xì)胞結(jié)合，2020以上反以上反而解離而解離。4 4、作用時(shí)間、作用時(shí)間 抗原抗體反應(yīng)應(yīng)有足夠的時(shí)間，不同反抗原抗體反應(yīng)應(yīng)有足夠的時(shí)間，不同反應(yīng)時(shí)間不同。應(yīng)時(shí)間不同。 此外，抗原抗體反應(yīng)在液相中反應(yīng)時(shí)此外，抗原抗體反應(yīng)在液相中反應(yīng)時(shí)，適當(dāng)振蕩與攪拌，也可促進(jìn)抗原抗體，適當(dāng)振蕩與攪拌，也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。分子的接觸，加速反應(yīng)。 電解質(zhì)電解質(zhì): :

23、生理鹽水或緩沖液生理鹽水或緩沖液酸堿度酸堿度: pH6pH9溫溫 度度: 1540，37最適最適二、環(huán)境因素二、環(huán)境因素反應(yīng)類型反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷結(jié)果判斷凝集反應(yīng)凝集反應(yīng) 直接凝集試驗(yàn)直接凝集試驗(yàn)觀察凝集現(xiàn)象觀察凝集現(xiàn)象間接凝集試驗(yàn)間接凝集試驗(yàn)同上同上抗球蛋白試驗(yàn)抗球蛋白試驗(yàn)同上同上沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng) 液相沉淀試驗(yàn)液相沉淀試驗(yàn)觀察沉淀，檢測濁度觀察沉淀，檢測濁度免疫電泳技術(shù)免疫電泳技術(shù)觀察掃描沉淀峰、沉淀弧觀察掃描沉淀峰、沉淀弧補(bǔ)體參與補(bǔ)體參與的反應(yīng)的反應(yīng)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)補(bǔ)體溶血試驗(yàn)觀察測定溶血現(xiàn)象觀察測定溶血現(xiàn)象補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)同上同上第四節(jié)第四節(jié) 免疫學(xué)檢測技術(shù)的類型免疫學(xué)

24、檢測技術(shù)的類型反應(yīng)類型反應(yīng)類型實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)果判斷結(jié)果判斷中和反應(yīng)中和反應(yīng)病毒中和試驗(yàn)病毒中和試驗(yàn)檢測病毒感染性檢測病毒感染性毒素中和試驗(yàn)毒素中和試驗(yàn)檢測外毒素毒性檢測外毒素毒性標(biāo)記免疫反應(yīng)標(biāo)記免疫反應(yīng)熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)檢測熒光現(xiàn)象檢測熒光現(xiàn)象放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)檢測放射性強(qiáng)度檢測放射性強(qiáng)度酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)檢測酶底物顯色檢測酶底物顯色發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)檢測發(fā)光強(qiáng)度檢測發(fā)光強(qiáng)度金免疫技術(shù)金免疫技術(shù)檢測金顆粒沉淀檢測金顆粒沉淀n原理：將可溶性抗原層積于抗體之上，如果二者相應(yīng)，則可在抗原、抗體兩液接觸界面形成白色的沉淀環(huán)環(huán)狀沉淀反應(yīng)試驗(yàn)組陽性對(duì)照組 陰性對(duì)照組n 原理：原理：

25、 可溶性可溶性Ag與與Ab在含有電解質(zhì)的半固體（在含有電解質(zhì)的半固體（1%）瓊）瓊脂內(nèi)進(jìn)行自由擴(kuò)散，當(dāng)兩者由高濃度向低濃度擴(kuò)散脂內(nèi)進(jìn)行自由擴(kuò)散，當(dāng)兩者由高濃度向低濃度擴(kuò)散相遇時(shí)，如果二者相對(duì)應(yīng)而且比例適當(dāng)，則可在相相遇時(shí)，如果二者相對(duì)應(yīng)而且比例適當(dāng)，則可在相遇處形成白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。另外，沉淀遇處形成白色的沉淀線，為陽性反應(yīng)。另外，沉淀帶對(duì)于組成它的帶對(duì)于組成它的Ag、Ab具有特異地不可透過性，而具有特異地不可透過性，而對(duì)其它的對(duì)其它的Ag與與Ab是可透過的，所以一條沉淀帶僅代是可透過的，所以一條沉淀帶僅代表一種表一種AgAb系統(tǒng)的沉淀物。系統(tǒng)的沉淀物。雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測抗原制備技術(shù)

26、檢測抗原制備技術(shù) 抗原是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異抗原是一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)外發(fā)生特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)，或稱免疫原。性反應(yīng)的物質(zhì)，或稱免疫原。 完全抗原完全抗原:反應(yīng)原性反應(yīng)原性+免疫原性免疫原性 半抗原半抗原(不完全抗原不完全抗原):只具備反應(yīng)原性而無只具備反應(yīng)原性而無免疫原性的物質(zhì)。免疫原性的物質(zhì)。 來源于病原體及其病原體的代謝、分泌和來源于病原體及其病原體的代謝、分泌和排泄物等排泄物等天然抗原天然抗原，均可作為良好的檢測，均可作為良好的檢測抗原。

27、抗原。 其種類，因病原體的種株不同而異。微生其種類，因病原體的種株不同而異。微生物中的衣原體、支原體、細(xì)菌、螺旋體、物中的衣原體、支原體、細(xì)菌、螺旋體、立克次體、真菌和放線菌等病原體表層結(jié)立克次體、真菌和放線菌等病原體表層結(jié)構(gòu)蛋白以及各種外毒素、內(nèi)毒素和酶等毒構(gòu)蛋白以及各種外毒素、內(nèi)毒素和酶等毒力因子，噬菌體、病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白，力因子，噬菌體、病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白，如衣殼蛋白、包膜上的各種糖蛋白、基質(zhì)如衣殼蛋白、包膜上的各種糖蛋白、基質(zhì)蛋白以及病毒編碼的復(fù)制酶等均是良好的蛋白以及病毒編碼的復(fù)制酶等均是良好的檢測抗原。檢測抗原。 大多數(shù)寄生蟲是多細(xì)胞生物，其抗原具有大多數(shù)寄生蟲是多細(xì)胞生物，其抗

28、原具有復(fù)雜性、多源性，同時(shí)又具有種屬和生活復(fù)雜性、多源性，同時(shí)又具有種屬和生活史不同期的特異性。來源于蟲體結(jié)構(gòu)性物史不同期的特異性。來源于蟲體結(jié)構(gòu)性物質(zhì)的蟲體抗原、蟲體排泄物和分泌物中的質(zhì)的蟲體抗原、蟲體排泄物和分泌物中的蛋白或多蛋白或多肽類、糖脂或多糖等代謝性抗原肽類、糖脂或多糖等代謝性抗原以及生活蟲體排放或脫落到宿主體內(nèi)可出以及生活蟲體排放或脫落到宿主體內(nèi)可出現(xiàn)于血循環(huán)的現(xiàn)于血循環(huán)的大分子微粒性循環(huán)抗原等均大分子微粒性循環(huán)抗原等均可作為檢測抗原。可作為檢測抗原。 抗生素抗生素等藥物因其分子量較小，不具有抗等藥物因其分子量較小，不具有抗原性。原性。與牛血清白蛋白等大分子偶聯(lián)后才與牛血清白蛋白

29、等大分子偶聯(lián)后才具有完全抗原的特性具有完全抗原的特性。 來源于自然感染或人工感染以及人工培養(yǎng)來源于自然感染或人工感染以及人工培養(yǎng)病原生物體的生物大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)病原生物體的生物大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、酶類等，必須進(jìn)行、多肽、酶類等，必須進(jìn)行分離純化分離純化，才，才能作為特異性較好的檢測抗原。能作為特異性較好的檢測抗原。 分離純化方法有選擇性沉淀法、有機(jī)溶劑分離純化方法有選擇性沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、電泳法、超速離沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、電泳法、超速離心法、層析法等。心法、層析法等。 其中用于蛋白質(zhì)和酶的提取，多采用選擇其中用于蛋白質(zhì)和酶的提取，多采用選擇性沉淀法、有機(jī)溶劑沉

30、淀法和等電點(diǎn)沉淀性沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法。法。（一）分離純化法（一）分離純化法（1）飽和硫酸銨法）飽和硫酸銨法：鹽析沉淀法是經(jīng)典的：鹽析沉淀法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)和酶純化分離技術(shù)。最常用的方法蛋白質(zhì)和酶純化分離技術(shù)。最常用的方法是以是以33%50%的飽和硫酸銨依次沉淀的飽和硫酸銨依次沉淀3次次。將鹽析沉淀后的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋。將鹽析沉淀后的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，用蒸餾水或緩沖液，中，用蒸餾水或緩沖液，4冰箱內(nèi)進(jìn)行冰箱內(nèi)進(jìn)行透析，更換蒸餾水或緩沖液透析，更換蒸餾水或緩沖液3次，直至袋次，直至袋內(nèi)鹽充分透析除盡為止。此外，亦可用葡內(nèi)鹽充分透析除盡為止。此外，亦可用葡聚糖凝膠層析法脫鹽

31、。聚糖凝膠層析法脫鹽。（一）分離純化法（一）分離純化法（2）有機(jī)溶劑沉淀法：常用乙醇或丙酮，）有機(jī)溶劑沉淀法：常用乙醇或丙酮，加入時(shí)應(yīng)攪拌均勻，加入時(shí)應(yīng)攪拌均勻，pH值大多控制在待值大多控制在待沉淀蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，置沉淀蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近，置4冰箱內(nèi)冰箱內(nèi)進(jìn)行進(jìn)行。（3）分子篩層析法：）分子篩層析法： 又稱凝膠過濾法，它是利用分子篩將抗又稱凝膠過濾法，它是利用分子篩將抗原分成大、中、小三種類型。特別是經(jīng)過原分成大、中、小三種類型。特別是經(jīng)過初步純化后的蛋白質(zhì)和酶抗原采用此種方初步純化后的蛋白質(zhì)和酶抗原采用此種方法進(jìn)一步純化，效果尤為顯著。法進(jìn)一步純化，效果尤為顯著。（一）分離純化法（一）分

32、離純化法（4）親和層析法：親和層析法則是利用生）親和層析法：親和層析法則是利用生物大分子的生物學(xué)特異性而設(shè)計(jì)的層析分物大分子的生物學(xué)特異性而設(shè)計(jì)的層析分離技術(shù)。例如抗原抗體、酶和酶抑制劑或離技術(shù)。例如抗原抗體、酶和酶抑制劑或配體、酶蛋白和輔酶、配體、酶蛋白和輔酶、DNA和和RNA、激、激素和受體等之間具有特殊的親和力，在一素和受體等之間具有特殊的親和力，在一定條件下，二者能緊密結(jié)合形成復(fù)合物。定條件下，二者能緊密結(jié)合形成復(fù)合物。如果將其中的一方面固定在載體上，則可如果將其中的一方面固定在載體上，則可從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方。親和從溶液中提取和分離相應(yīng)的另一方。親和層析可以達(dá)到很高的純度。

33、有時(shí)僅需進(jìn)行層析可以達(dá)到很高的純度。有時(shí)僅需進(jìn)行一步純化即可達(dá)到純化的目的。一步純化即可達(dá)到純化的目的。（二）抗原定性鑒定（二）抗原定性鑒定 純化蛋白質(zhì)抗原的定性鑒定常用的方法純化蛋白質(zhì)抗原的定性鑒定常用的方法有有：免疫電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。：免疫電泳及聚丙烯酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)抗原濃度的定量測定可用雙縮純化蛋白質(zhì)抗原濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法。脲法、酚試劑法或紫外光吸收法。（三）抗原的濃縮（三）抗原的濃縮 （1）純化后的抗原常用聚乙二醇（）純化后的抗原常用聚乙二醇（PEG）、凝膠和蔗糖等吸收劑進(jìn)行）、凝膠和蔗糖等吸收劑進(jìn)行濃縮濃縮。使用。使用PEG或蔗糖吸

34、收劑時(shí)，先將生物大分子溶或蔗糖吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入透析袋里，扎緊袋口，外加吸收劑液裝入透析袋里，扎緊袋口，外加吸收劑覆蓋，袋內(nèi)溶劑滲出被吸收劑吸去，吸收覆蓋，袋內(nèi)溶劑滲出被吸收劑吸去，吸收劑被溶劑飽和后，亦可更換，直至濃縮至劑被溶劑飽和后，亦可更換，直至濃縮至所需濃度為止。吸收劑可經(jīng)加熱除去吸收所需濃度為止。吸收劑可經(jīng)加熱除去吸收的水分后再次使用。將生物大分子溶液裝的水分后再次使用。將生物大分子溶液裝入透析袋，扎緊袋口，然后將透析袋置電入透析袋，扎緊袋口，然后將透析袋置電扇旁吹風(fēng)，促使水分緩慢蒸發(fā)，可起到濃扇旁吹風(fēng)，促使水分緩慢蒸發(fā)，可起到濃縮作用?？s作用。（三）抗原的濃縮（三）抗原的濃縮（2）超濾濃縮是使用一種特定孔徑的）超濾濃縮是使用一種特定孔徑的濾膜濾膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行