高效液相色譜法測定羥基卡馬西平血藥濃度

1、高效液相色譜法測定羥基卡馬西平血藥濃度        【摘要】     目的：建立測定血清羥基卡馬西平濃度的高效液相色譜法。方法：以C18反相柱（Hypersil C18，4.6 mm×200 mm，10 m）為色譜柱，流動相為甲醇水（4060），流速為0.8 mL/min，檢測波長230 nm，以乙醚為提取劑。結(jié)果：羥基卡馬西平低、中、高（0.74、5.90、23.60 mg/L）3種濃度的平均回收率分別為100.2%、94.9%和90.1%，日內(nèi)及日間

2、RSD均小于5%（n=5）；線性范圍為0.4759.00 mg/L，回歸方程C=0.03293A+0.01032，r=0.9998。結(jié)論：該方法靈敏、準(zhǔn)確、簡單、快速，取血量少，適用于羥基卡馬西平血藥濃度的監(jiān)測和藥動學(xué)研究。     【關(guān)鍵詞】  羥基卡馬西平；高效液相色譜法；血藥濃度    Determination of monohydroxycarbazepine in serum by HPLC    PANG Dezhi, SONG Xinwen, WANG Yan

3、g, ZHANG Huanian, XU Hua (The Childrens Hospital of Wuhan, Hubei Wuhan  430016, China)    Abstract Objective:To set up an HPLC method for the determination of the monohydroxycarbazepine (MHD) in blood serum.Methods:The MHD was analyzed in a reverse phase HPLC system (C18 column,

4、200 mm×4.6 mm, 10 m); the mobile phase was methanolwater (4060) with a flow rate of 0.8 mL·min-1 and UV detection wavelength of 230 nm. Serum samples containing the drug were extracted with ether.Results:The average recovery rate of the MHD in low, medium and high concentrations (0.74,5.90

5、,23.60 mg·L-1) were 100.2%, 94.9% and 90.1% respectively. The interday and intraday relative standard deviations were less than 5% (n=5). The calibration curve had a good linearity while the concentration of MHD was within the range of 0.4759.00 mg·L-1.The regression equation was C=0.03293

6、A+0.01032,r=0.9998.Conclusions:The method is sensitive, accurate, handy and speedy, and may be used in the monitoring of the serum concentration of MHD and pharmacokinetic studies of the drug.    Key words  Monohydroxcarbazepine;  HPLC; Serum concentration  羥基卡馬西平（monoh

7、ydroxycarbazepine，MHD）是奧卡西平的活性代謝產(chǎn)物，奧卡西平口服后可迅速吸收，并通過首過效應(yīng)幾乎全部轉(zhuǎn)化為MHD。雖然奧卡西平本身也有抗癲癇效應(yīng)，但實際上真正在體內(nèi)發(fā)揮作用的主要還是其活性代謝產(chǎn)物羥基卡馬西平，故臨床上往往通過測定MHD的血藥濃度來判斷奧卡西平的療效和不良反應(yīng)。目前國內(nèi)關(guān)于羥基卡馬西平血藥濃度測定的方法主要是高效液相色譜法14，但這些方法都是采用內(nèi)標(biāo)法進行測定，操作較繁瑣，且所需血樣量較多，要在兒科臨床普遍應(yīng)用尚有不足。為此，本文建立了一種用外標(biāo)法進行定量、簡便快速、所需血樣量較少的反相高效液相色譜（RPHPLC）測定小兒血清羥基卡馬西平濃度的方法。 

8、;   1  儀器與試藥    1.1  儀器    Agilent 1100高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵，G13222脫氣機，G1313A柱溫箱，G1314AUV紫外檢測器，HP化學(xué)工作站（美國HP公司）；WH1微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；LDZ40.8A臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；AB204萬分之一電子分析天平（瑞士產(chǎn)）。    1.2  試劑與藥品    羥基卡馬西平對照品（華中科技大學(xué)同濟藥學(xué)院

9、提供，批號051020，純度>99），奧卡西平對照品（華中科技大學(xué)同濟藥學(xué)院提供，批號051028，純度99.8），卡馬西平對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號01429503），苯巴比妥對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號12229602），硝基安定對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號12179701），氯硝西泮對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號171227200302），乙醚（分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠，批號070321），甲醇為色譜純，水為超純水。    2  方法與結(jié)果    2.1  色譜

10、條件    色譜柱為Hypersil C18柱（4.6 mm×200 mm，10 m）；流動相為甲醇水（4060），流速0.8 mL/min；柱溫30 ；檢測波長為230 nm；進樣量20 L。    2.2  貯備溶液的配制    精密稱取羥基卡馬西平對照品11.8 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后定容至刻度即成羥基卡馬西平貯備液（118 mg/L），置4 冰箱保存。臨用時將貯備液用甲醇稀釋至所需濃度即得羥基卡馬西平工作液。    2.

11、3  樣品處理    精密吸取樣品血清100 L置5 mL離心試管中，加入4 mL乙醚進行旋渦振蕩萃取2 min，2 000 r/min離心3 min，吸取乙醚層，如此操作3次，合并3次乙醚，置40 水浴蒸干，殘渣加流動相100 L溶解。    2.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線    用羥基卡馬西平貯備液按照逐級倍比稀釋的原則用甲醇制成濃度分別為0.47、0.93、1.85、3.70、7.40、14.80、29.50、59.00 mg/L的系列工作液，精密吸取各工作液1 mL置5 mL離心試管中，于

12、50 水浴中用氮氣吹干，然后分別精密加入1 mL空白人血清，漩渦混合10 min，即得與系列工作液濃度相同的含藥標(biāo)準(zhǔn)血清。取含藥標(biāo)準(zhǔn)血清100 L，照“2.3樣品處理”項下的方法進行操作，取20 L進樣測定，記錄色譜圖，以樣品濃度為C，峰面積為A，得回歸方程：C=0.03293A+0.01032，r=0.9998，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為：0.4759.00 mg/L。當(dāng)信噪比S/N=3時，MHD的最低檢測限為0.2 mg/L。MHD的保留時間約為11 min，見圖1。    圖1  羥基卡馬西平色譜圖    2.5 

13、 空白與干擾試驗    精密吸取空白血清100 L，照“2.3樣品處理”項下的方法進行操作，取20 L進樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果在11 min左右未見色譜峰，表明血清中的雜質(zhì)不影響MHD的測定。    另分別取奧卡西平、卡馬西平、苯巴比妥、硝西泮及氯硝西泮的對照液加入空白血清中，漩渦混勻后，照“2.3 樣品處理”項下的方法進行操作，取20 L進樣測定。結(jié)果奧卡西平的出峰時間為14.3 min，卡馬西平的出峰時間為26.5 min，苯巴比妥的出峰時間為9.7 min，硝西泮的出峰時間為29.9 min，氯硝西泮的出峰時間為29.2 mi

14、n，表明這5種常用的抗癲癇藥物亦不干擾MHD的測定。見圖2。    2.6  回收率和精密度試驗    準(zhǔn)確配制MHD濃度為0.74、5.90、23.60 mg/L的血清樣品各5份，按“2.3樣品處理”項下操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度，與配制濃度比較，得低、中、高3種濃度的方法回收率及日內(nèi)RSD；每天取上述配制樣品各5份連續(xù)測定3日，得日間RSD，結(jié)果見表1。表1  羥基卡馬西平（MHD）血清回收率及精密度    3  討論    羥基卡馬西平結(jié)

15、構(gòu)中有兩個苯環(huán)，有明顯的紫外吸收，在200400 nm的波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，其在210 nm波長處吸收度最大，在254 nm及270 nm處亦分別有吸收峰。但采用210 nm作為檢測波長1，4，由于其與甲醇的最大截止波長205 nm比較接近，實驗中發(fā)現(xiàn)流動相對測定的干擾較大且容易造成基線的嚴(yán)重波動，故不采用。254 nm和270 nm雖然也可作為檢測波長，但其吸收太小，需取血清0.5 mL進行測定，這樣造成患兒靜脈采血量較大。用230 nm作為檢測波長，其吸收度完全可滿足實際檢測的需要，同時所需血清僅為0.1 mL，特別適合于測定兒童羥基卡馬西平的血藥濃度。  

16、0; 羥基卡馬西平為非極性分子，脂溶性較高，可用乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚等進行提取，考慮到三氯甲烷有一定的毒性，乙酸乙酯的沸點稍高，故選用毒性較小、沸點很低、容易揮發(fā)的乙醚作為提取劑。實驗發(fā)現(xiàn)，用乙醚提取血清中的羥基卡馬西平，提取2次只能使回收率達70%80%左右，提取3次則可使回收率達90%以上。    苯巴比妥、卡馬西平、硝西泮以及氯硝西泮是目前兒科臨床上常用的一線抗癲癇藥物。本研究表明這幾種藥物與奧卡西平合用時均不影響其活性代謝產(chǎn)物羥基卡馬西平的測定，因此本文所建立的方法適合兒科臨床用于MHD的血清藥物濃度測定和藥動學(xué)研究。    【參考文獻】  1 付 琳, 邱相君, 代宗順, 等. 奧卡西平片的人體相對生物利用度研究J. 中國藥科大學(xué)學(xué)報, 2004, 35(3): 244247.    2 胡國新, 邱相君, 周紅宇. 反相高效液相色譜法測定奧卡西平活性代謝物及其在健康人