HPLC_ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量及相關試驗條件選擇的探討

1、藥材生產(chǎn)與質(zhì)量HPLC-ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量及相關試驗條件選擇的探討馬艷蓉1,劉泓2,柴國林3,張蒞峽2(1.浙江大學藥學系,浙江杭州310031;2.中國中醫(yī)研究院基礎理論研究所,北京100700;3.浙江亞克藥業(yè)有限公司,浙江杭州310053摘要:目的探討高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HP LC-ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量中相關試驗條件:如提取溶劑,溶劑濃度,提取方法及藥材粉碎度等的最佳選擇。方法采用HPL C-EL SD發(fā)光散射檢測法。結果黃芪甲苷在2.010.0L g與峰面積積分值呈良好的線性關系。(r=0.9997,n=5,平均回收率為97.9%(RSD=1.8%。結論在

2、合適條件下,HP L C-EL SD測定黃芪中黃芪甲苷含量是一值得推廣的方法。關鍵詞:黃芪;黃芪甲苷;HPL C-EL SD;條件試驗中圖分類號:R284.1文獻標識碼:A文章編號:1004-2199(200306-0017-03黃芪為常用中藥,具補氣固表,托瘡生肌,利水等功效,其藥用價值較高,現(xiàn)代藥理學研究表明,黃芪甲苷為其主要活性成分之一,在黃芪藥材以及含黃芪復方制劑中通常選為定量指標成份。中國藥典2000年版規(guī)定以豆科植物蒙古黃芪A stragalu membranaceus(FischBg e.var.mongholicus (BgeH siao或膜莢黃芪A.M embr anaceu

3、s(Fisch Bg e.的干燥根供藥用。以往測定黃芪甲苷的方法主要有比色法、薄層掃描法(TLCS1,2、(HPLC-UV3以及近幾年采用的HPLC-ELSD47。目前大多采用TLCS法為中國藥典2000年版法定方法,近期國家藥品監(jiān)督局下發(fā)國家藥品標準修訂批件,對“黃芪注射液含量測定將T LCS法改為HPLC-ELSD法測定6”,較好地解決了TLCS法的操作煩瑣、干擾較大及重現(xiàn)性差等不足。首次確立HPLC-ELSD法作為國家法定標準在中藥質(zhì)量監(jiān)測中的應用。而HPLC-U V法雖然有所應用,但因黃芪甲苷紫外最大吸收波長為200.8nm,且紫外吸收較弱,溶劑背景難以消除。而HPLC-ELSD法解決

4、了T LCS及HPLC-U V法的局限性,得以在實踐中很好應用。但目前見到的HPLC-ELSD法參考文獻,對黃芪中黃芪甲苷相關提取試驗條件未作詳盡的比較研究,本文在實驗中參照文獻方法進一步補充和完善,相信對含黃芪藥材及相關制劑中應用HPLC-ELSD法提供參考依據(jù)。1儀器與試藥1.1儀器HP1100高效液相色譜儀,Alltech500型蒸發(fā)光散射檢測器,HP3395積分儀,HGA-2000空氣發(fā)生器,Rheodyne7725I進樣閥,Hamilton25L l微量進樣器,CX-1超聲波清洗器。1.2試藥黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所;黃芪藥材及飲片1,2,3,4,5經(jīng)謝宗萬教授鑒定為蒙

5、古黃芪A str agalu membranaceus(FischBg e.v ar. mongholicus(Bg e.Hsiao。乙腈為色譜純,(南開大學精細化學實驗廠,其它試劑為分析純,水為高純水。2方法與結果2.1色譜條件色譜柱為YWGC18(10L m,4.6m m×200 m m;流動相:乙腈-水(12;室溫,流速0.8mlm in-1;ELSD參數(shù):漂移管溫度:107;氣體流速: 2.7mlmin-1。2.2供試品制備方法條件考察2.2.1提取溶媒的種類及濃度選擇文獻報道4以甲醇為提取溶媒,我們考察了不同種溶媒甲醇、乙醇及水提取,結果顯示黃芪甲苷單純水提取率比單17現(xiàn)代

6、中藥研究與實踐2003年第17卷第6期Resear ch and Pr actice of Chinese M edicines純甲醇或乙醇提取率高,進一步比較不同濃度甲醇和乙醇提取所含黃芪甲苷提取率,相應不同濃度甲醇較乙醇及水偏高,以甲醇、60%甲醇、40%甲醇及水提取率分別為0.12、0.20、0.22、0.15m gg-1生藥,以40%甲醇最高。以選擇40%甲醇提取為最佳選擇。2.2.2黃芪藥材粗粉過篩目數(shù)選擇將黃芪藥材粗粉分別過20、40及60目篩提取結果分別為(0.24、0.27、0.35mgg-1隨目數(shù)加大,遞增。以60目提取率最高,因黃芪本身粗纖維較多,不宜過更高目數(shù)篩,選擇以過

7、60目篩為妥。2.2.3提取方法選擇考察冷浸24h后沙氏提取器、單純冷浸24h及超聲提取三種方式,提取率分別為0.35、0.21、0.087mgg-1,結果以冷浸24h 后用沙氏提取器提取率最高。2.2.4過D101大孔樹脂柱洗脫液考察按文獻4水洗脫40%醇洗脫70%醇洗脫方法,經(jīng)考察,發(fā)現(xiàn)40%醇洗脫液中將除去帶走部分極性大的雜質(zhì)外,同時黃芪甲苷成份攜帶走近30%,而常溫水洗脫液中,將大部分水溶性雜質(zhì)帶走,損失可忽略,對保護色譜柱有利,因此實驗中,將40%醇洗脫步驟刪除,保留水和70%乙醇洗脫。2.3供試品溶液的制備,本品經(jīng)粉碎為粗品,過60目篩,精密稱取1.5g,置索氏提取器中,加40%甲

8、醇20ml冷浸過夜,再續(xù)加40%甲醇使之總量為50 ml,熱回流4h,提取液蒸干,殘渣加水10ml微熱溶解,加水飽和正丁醇振搖提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨試液洗2次,每次20ml,棄去氨液,正丁醇蒸干,殘渣加水5m l,使溶解,放冷。通過D101大孔樹脂柱(1.5cm×12cm,50m l水洗脫, 70%乙醇50ml洗脫,收集70%洗脫液,蒸干,甲醇溶解,并定容至2m l容量瓶中,經(jīng)0.45L m微孔濾膜過濾后,作為供試品溶液。2.4線性關系的考察精密稱定黃芪甲苷對照品10mg,加甲醇溶解并容至10ml容量瓶中,精密吸取2,4,6,8,10L l進樣,以進樣量(自然對數(shù)

9、為橫坐標,峰面積積分值(自然對數(shù)為縱坐標,線性回歸方程Y=1.5210X +12.1663,r=0.9997,進樣量在210L g呈良好線性關系。2.5精密度實驗精密吸取同一份樣品20L l,重復進樣6次, R SD2.3%。2.6重復性實驗同一份樣品按制備方法平行制備5份,含量平均值為0.36mgg-1生藥,R SD為1.9%。2.7穩(wěn)定性實驗按照樣品測定項下進行,對同一份樣品,先后在0,1,2,4,8h進行測定,計算R SD1.2%。2.8回收率測定采用加樣回收率測定法。取已知含量的樣品約0.75g,精密加入黃芪甲苷對照品溶液0.0500m g ml-110ml(按11加入。按上述供試品樣

10、品制備及色譜條件測定。測定結果見表1。表1回收率測定結果序號樣品量mg測得量mg回收率%x%RS D%10.48010.968997.7620.47820.976199.5830.50140.988797.4697.9 1.840.49650.972895.2650.48990.988399.682.9樣品測定,見表2。表2不同樣品測定結果序號樣品產(chǎn)地、提供單位含量(m gg-1外觀性狀特征1蒙古黃芪內(nèi)蒙海南亞洲藥廠0.64綿性大、柴性小、甜度高、發(fā)粘2蒙古黃芪內(nèi)蒙(三年生北京同仁醫(yī)院眼科所0.19柴性大、空心3蒙古黃芪內(nèi)蒙北京同仁醫(yī)院眼科所0.36柴性略小、粘性略大4蒙古黃芪山西(一年生北京

11、同仁醫(yī)院眼科所0.17柴性大、纖維化強5蒙古黃芪飲片北京購北京同仁醫(yī)院眼科所0.073潮濕(測水份含量13.0%、柴性大、纖維化強3討論3.1曾試驗甲醇水不同比例(7525,(4060及乙腈-水等不同比例流動相,確認參考文獻1乙腈-水(23或(12,達基線分離、分離良好,乙腈比例加大黃芪甲苷相對保留時間減少,因此仍以乙腈-水(12出峰保留時間適度,尚可節(jié)省時間,節(jié)省有機溶媒,達到有效分離。3.2按ELSD檢測器設置要求計算并確定漂浮管溫度為107、氣體流速為2.7Lmin-1,流速過高或過低會直接影響信噪比,溫度過高或過低直接影18現(xiàn)代中藥研究與實踐2003年第17卷第6期Resear ch

12、and Pr actice of Chinese M edicines響溶劑的揮發(fā)程度,否則將會影響基線的穩(wěn)定性,應嚴格遵循儀器設置要求,可適當調(diào)整。3.3有關計算問題,曾用同一組數(shù)據(jù),用常規(guī)計算法、自然對數(shù)及常用對數(shù)法計算結果,前者線性關系不好,用后二者無顯著區(qū)別。3.4HPLC-ELSD 法,操作簡便,且不受外界環(huán)境干擾,試劑在檢測中全部蒸發(fā),靈敏度穩(wěn)定性及重現(xiàn)性很高,確定是一種值得推廣應用的檢測黃芪及相關制劑中黃芪甲苷成份的最新而適用的方法。3.5樣品測試結果,其含量高低與藥材外觀形狀有一定相關性,綿性大,柴性小,發(fā)粘含黃芪甲苷較高;柴性大纖維性強,含量低;飲片經(jīng)炮制處理,含水量較高,含

13、量偏低是否在加工中造成成分損失之故,有待進一步探討。參考文獻1王寶王王木.中成藥質(zhì)量標準物質(zhì)研究M .北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1994.538.2付鐵軍,李伯剛,及元喬,等.HPLC 法測定黃芪注射液中黃芪甲苷的含量J .天然產(chǎn)物的研究與發(fā)展,1997,9(4:53.3國家藥典委員會.中國藥典(一部S .2000.249.4周春玲,魯靜.高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測測定黃芪中黃芪甲苷的含量J .中國中藥雜志,2000,25(3:66.5田南卉,楊國紅,張鯤,等.HPL C ELSD 檢測測定黃芪和制劑中黃芪甲苷含量M ,迪馬公司,蒸發(fā)光散射檢測器應用文獻和技術參考,2001.6鄧海銀.HPLC

14、 儀器的通用質(zhì)量檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(EL SDJ ,藥物分析,1994,14(3:61.7國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標準修訂批件,2001年ZFBO 171.(收稿日期:2003-09-27Assays of Astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED andStudies on Its Choosing of the Condition TestMA Yan -r ong 1,LIU Hong 2,ZHANG Li -x ia 2,CHAI Guo -lin3(1.Pharmacy School,Zhejiang U niv ersit

15、y ,Hang zhou 310031,China;2.Institute of Basic Theory of T CM ,China Academ y of Tr aditio nal Chinese M edicine,Beijing 100700,China ;3.Zhejiang Yake Pharmaceutical Co .,Ltd .,Hangzhou 310053,China Abstract :Objective To study the HPLC-ELED m ethod for the assay s of astrag aloside in Radix Astrag

16、ali and determine the most suitable testing condition such as choosed solvent ,concentration o f the so lvent ,the w ay of the ex tr action and the g ranularity o f the raw m aterial ,etc .Method The HPLC -ELSD metho d w as used.Result The standard curve w as linear at the range of 2.010.0L g fo r a

17、strag alo side (r =0.9997,n =5,the average reco very was 97.9%(RS D =1.8%.Conclusion U nder suitable condition,the method of determ ining astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED is w or th to be po pularized .Key words :Radix Astragali ;astrag aloside ;HPLC -ELED ;condition test封面介紹上海華宇藥業(yè)有限公司簡介上海華宇藥業(yè)有限公司是目前國內(nèi)最大的中藥材生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)之一,是由中國藥材集團公司和上海市藥材有限公