HPLC_ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量及相關(guān)試驗(yàn)條件選擇的探討

1、藥材生產(chǎn)與質(zhì)量HPLC-ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量及相關(guān)試驗(yàn)條件選擇的探討馬艷蓉1,劉泓2,柴國林3,張蒞峽2(1.浙江大學(xué)藥學(xué)系,浙江杭州310031;2.中國中醫(yī)研究院基礎(chǔ)理論研究所,北京100700;3.浙江亞克藥業(yè)有限公司,浙江杭州310053摘要:目的探討高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HP LC-ELSD測定黃芪中黃芪甲苷含量中相關(guān)試驗(yàn)條件:如提取溶劑,溶劑濃度,提取方法及藥材粉碎度等的最佳選擇。方法采用HPL C-EL SD發(fā)光散射檢測法。結(jié)果黃芪甲苷在2.010.0L g與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。(r=0.9997,n=5,平均回收率為97.9%(RSD=1.8%。結(jié)論在

2、合適條件下,HP L C-EL SD測定黃芪中黃芪甲苷含量是一值得推廣的方法。關(guān)鍵詞:黃芪;黃芪甲苷;HPL C-EL SD;條件試驗(yàn)中圖分類號(hào):R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1004-2199(200306-0017-03黃芪為常用中藥,具補(bǔ)氣固表,托瘡生肌,利水等功效,其藥用價(jià)值較高,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,黃芪甲苷為其主要活性成分之一,在黃芪藥材以及含黃芪復(fù)方制劑中通常選為定量指標(biāo)成份。中國藥典2000年版規(guī)定以豆科植物蒙古黃芪A stragalu membranaceus(FischBg e.var.mongholicus (BgeH siao或膜莢黃芪A.M embr anaceu

3、s(Fisch Bg e.的干燥根供藥用。以往測定黃芪甲苷的方法主要有比色法、薄層掃描法(TLCS1,2、(HPLC-UV3以及近幾年采用的HPLC-ELSD47。目前大多采用TLCS法為中國藥典2000年版法定方法,近期國家藥品監(jiān)督局下發(fā)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂批件,對(duì)“黃芪注射液含量測定將T LCS法改為HPLC-ELSD法測定6”,較好地解決了TLCS法的操作煩瑣、干擾較大及重現(xiàn)性差等不足。首次確立HPLC-ELSD法作為國家法定標(biāo)準(zhǔn)在中藥質(zhì)量監(jiān)測中的應(yīng)用。而HPLC-U V法雖然有所應(yīng)用,但因黃芪甲苷紫外最大吸收波長為200.8nm,且紫外吸收較弱,溶劑背景難以消除。而HPLC-ELSD法解決

4、了T LCS及HPLC-U V法的局限性,得以在實(shí)踐中很好應(yīng)用。但目前見到的HPLC-ELSD法參考文獻(xiàn),對(duì)黃芪中黃芪甲苷相關(guān)提取試驗(yàn)條件未作詳盡的比較研究,本文在實(shí)驗(yàn)中參照文獻(xiàn)方法進(jìn)一步補(bǔ)充和完善,相信對(duì)含黃芪藥材及相關(guān)制劑中應(yīng)用HPLC-ELSD法提供參考依據(jù)。1儀器與試藥1.1儀器HP1100高效液相色譜儀,Alltech500型蒸發(fā)光散射檢測器,HP3395積分儀,HGA-2000空氣發(fā)生器,Rheodyne7725I進(jìn)樣閥,Hamilton25L l微量進(jìn)樣器,CX-1超聲波清洗器。1.2試藥黃芪甲苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所;黃芪藥材及飲片1,2,3,4,5經(jīng)謝宗萬教授鑒定為蒙

5、古黃芪A str agalu membranaceus(FischBg e.v ar. mongholicus(Bg e.Hsiao。乙腈為色譜純,(南開大學(xué)精細(xì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠,其它試劑為分析純,水為高純水。2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱為YWGC18(10L m,4.6m m×200 m m;流動(dòng)相:乙腈-水(12;室溫,流速0.8mlm in-1;ELSD參數(shù):漂移管溫度:107;氣體流速: 2.7mlmin-1。2.2供試品制備方法條件考察2.2.1提取溶媒的種類及濃度選擇文獻(xiàn)報(bào)道4以甲醇為提取溶媒,我們考察了不同種溶媒甲醇、乙醇及水提取,結(jié)果顯示黃芪甲苷單純水提取率比單17現(xiàn)代

6、中藥研究與實(shí)踐2003年第17卷第6期Resear ch and Pr actice of Chinese M edicines純甲醇或乙醇提取率高,進(jìn)一步比較不同濃度甲醇和乙醇提取所含黃芪甲苷提取率,相應(yīng)不同濃度甲醇較乙醇及水偏高,以甲醇、60%甲醇、40%甲醇及水提取率分別為0.12、0.20、0.22、0.15m gg-1生藥,以40%甲醇最高。以選擇40%甲醇提取為最佳選擇。2.2.2黃芪藥材粗粉過篩目數(shù)選擇將黃芪藥材粗粉分別過20、40及60目篩提取結(jié)果分別為(0.24、0.27、0.35mgg-1隨目數(shù)加大,遞增。以60目提取率最高,因黃芪本身粗纖維較多,不宜過更高目數(shù)篩,選擇以過

7、60目篩為妥。2.2.3提取方法選擇考察冷浸24h后沙氏提取器、單純冷浸24h及超聲提取三種方式,提取率分別為0.35、0.21、0.087mgg-1,結(jié)果以冷浸24h 后用沙氏提取器提取率最高。2.2.4過D101大孔樹脂柱洗脫液考察按文獻(xiàn)4水洗脫40%醇洗脫70%醇洗脫方法,經(jīng)考察,發(fā)現(xiàn)40%醇洗脫液中將除去帶走部分極性大的雜質(zhì)外,同時(shí)黃芪甲苷成份攜帶走近30%,而常溫水洗脫液中,將大部分水溶性雜質(zhì)帶走,損失可忽略,對(duì)保護(hù)色譜柱有利,因此實(shí)驗(yàn)中,將40%醇洗脫步驟刪除,保留水和70%乙醇洗脫。2.3供試品溶液的制備,本品經(jīng)粉碎為粗品,過60目篩,精密稱取1.5g,置索氏提取器中,加40%甲

8、醇20ml冷浸過夜,再續(xù)加40%甲醇使之總量為50 ml,熱回流4h,提取液蒸干,殘?jiān)铀?0ml微熱溶解,加水飽和正丁醇振搖提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨試液洗2次,每次20ml,棄去氨液,正丁醇蒸干,殘?jiān)铀?m l,使溶解,放冷。通過D101大孔樹脂柱(1.5cm×12cm,50m l水洗脫, 70%乙醇50ml洗脫,收集70%洗脫液,蒸干,甲醇溶解,并定容至2m l容量瓶中,經(jīng)0.45L m微孔濾膜過濾后,作為供試品溶液。2.4線性關(guān)系的考察精密稱定黃芪甲苷對(duì)照品10mg,加甲醇溶解并容至10ml容量瓶中,精密吸取2,4,6,8,10L l進(jìn)樣,以進(jìn)樣量(自然對(duì)數(shù)

9、為橫坐標(biāo),峰面積積分值(自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),線性回歸方程Y=1.5210X +12.1663,r=0.9997,進(jìn)樣量在210L g呈良好線性關(guān)系。2.5精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一份樣品20L l,重復(fù)進(jìn)樣6次, R SD2.3%。2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)同一份樣品按制備方法平行制備5份,含量平均值為0.36mgg-1生藥,R SD為1.9%。2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照樣品測定項(xiàng)下進(jìn)行,對(duì)同一份樣品,先后在0,1,2,4,8h進(jìn)行測定,計(jì)算R SD1.2%。2.8回收率測定采用加樣回收率測定法。取已知含量的樣品約0.75g,精密加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.0500m g ml-110ml(按11加入。按上述供試品樣

10、品制備及色譜條件測定。測定結(jié)果見表1。表1回收率測定結(jié)果序號(hào)樣品量mg測得量mg回收率%x%RS D%10.48010.968997.7620.47820.976199.5830.50140.988797.4697.9 1.840.49650.972895.2650.48990.988399.682.9樣品測定,見表2。表2不同樣品測定結(jié)果序號(hào)樣品產(chǎn)地、提供單位含量(m gg-1外觀性狀特征1蒙古黃芪內(nèi)蒙海南亞洲藥廠0.64綿性大、柴性小、甜度高、發(fā)粘2蒙古黃芪內(nèi)蒙(三年生北京同仁醫(yī)院眼科所0.19柴性大、空心3蒙古黃芪內(nèi)蒙北京同仁醫(yī)院眼科所0.36柴性略小、粘性略大4蒙古黃芪山西(一年生北京

11、同仁醫(yī)院眼科所0.17柴性大、纖維化強(qiáng)5蒙古黃芪飲片北京購北京同仁醫(yī)院眼科所0.073潮濕(測水份含量13.0%、柴性大、纖維化強(qiáng)3討論3.1曾試驗(yàn)甲醇水不同比例(7525,(4060及乙腈-水等不同比例流動(dòng)相,確認(rèn)參考文獻(xiàn)1乙腈-水(23或(12,達(dá)基線分離、分離良好,乙腈比例加大黃芪甲苷相對(duì)保留時(shí)間減少,因此仍以乙腈-水(12出峰保留時(shí)間適度,尚可節(jié)省時(shí)間,節(jié)省有機(jī)溶媒,達(dá)到有效分離。3.2按ELSD檢測器設(shè)置要求計(jì)算并確定漂浮管溫度為107、氣體流速為2.7Lmin-1,流速過高或過低會(huì)直接影響信噪比,溫度過高或過低直接影18現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐2003年第17卷第6期Resear ch

12、and Pr actice of Chinese M edicines響溶劑的揮發(fā)程度,否則將會(huì)影響基線的穩(wěn)定性,應(yīng)嚴(yán)格遵循儀器設(shè)置要求,可適當(dāng)調(diào)整。3.3有關(guān)計(jì)算問題,曾用同一組數(shù)據(jù),用常規(guī)計(jì)算法、自然對(duì)數(shù)及常用對(duì)數(shù)法計(jì)算結(jié)果,前者線性關(guān)系不好,用后二者無顯著區(qū)別。3.4HPLC-ELSD 法,操作簡便,且不受外界環(huán)境干擾,試劑在檢測中全部蒸發(fā),靈敏度穩(wěn)定性及重現(xiàn)性很高,確定是一種值得推廣應(yīng)用的檢測黃芪及相關(guān)制劑中黃芪甲苷成份的最新而適用的方法。3.5樣品測試結(jié)果,其含量高低與藥材外觀形狀有一定相關(guān)性,綿性大,柴性小,發(fā)粘含黃芪甲苷較高;柴性大纖維性強(qiáng),含量低;飲片經(jīng)炮制處理,含水量較高,含

13、量偏低是否在加工中造成成分損失之故,有待進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)1王寶王王木.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究M .北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1994.538.2付鐵軍,李伯剛,及元喬,等.HPLC 法測定黃芪注射液中黃芪甲苷的含量J .天然產(chǎn)物的研究與發(fā)展,1997,9(4:53.3國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部S .2000.249.4周春玲,魯靜.高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測測定黃芪中黃芪甲苷的含量J .中國中藥雜志,2000,25(3:66.5田南卉,楊國紅,張鯤,等.HPL C ELSD 檢測測定黃芪和制劑中黃芪甲苷含量M ,迪馬公司,蒸發(fā)光散射檢測器應(yīng)用文獻(xiàn)和技術(shù)參考,2001.6鄧海銀.HPLC

14、 儀器的通用質(zhì)量檢測器蒸發(fā)光散射檢測器(EL SDJ ,藥物分析,1994,14(3:61.7國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂批件,2001年ZFBO 171.(收稿日期:2003-09-27Assays of Astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED andStudies on Its Choosing of the Condition TestMA Yan -r ong 1,LIU Hong 2,ZHANG Li -x ia 2,CHAI Guo -lin3(1.Pharmacy School,Zhejiang U niv ersit

15、y ,Hang zhou 310031,China;2.Institute of Basic Theory of T CM ,China Academ y of Tr aditio nal Chinese M edicine,Beijing 100700,China ;3.Zhejiang Yake Pharmaceutical Co .,Ltd .,Hangzhou 310053,China Abstract :Objective To study the HPLC-ELED m ethod for the assay s of astrag aloside in Radix Astrag

16、ali and determine the most suitable testing condition such as choosed solvent ,concentration o f the so lvent ,the w ay of the ex tr action and the g ranularity o f the raw m aterial ,etc .Method The HPLC -ELSD metho d w as used.Result The standard curve w as linear at the range of 2.010.0L g fo r a

17、strag alo side (r =0.9997,n =5,the average reco very was 97.9%(RS D =1.8%.Conclusion U nder suitable condition,the method of determ ining astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED is w or th to be po pularized .Key words :Radix Astragali ;astrag aloside ;HPLC -ELED ;condition test封面介紹上海華宇藥業(yè)有限公司簡介上海華宇藥業(yè)有限公司是目前國內(nèi)最大的中藥材生產(chǎn)經(jīng)營企業(yè)之一,是由中國藥材集團(tuán)公司和上海市藥材有限公