高效液相色譜法測(cè)定兔血漿中黃芩苷的含量

1、高效液相色譜法測(cè)定兔血漿中黃芩苷的含量         10-02-07 09:52:00     編輯：studa20                       作者：蔣晪，王鵬嬌, 張敏，高秀麗【摘要】  目的： 建立測(cè)定兔血漿中黃芩

2、苷的含量測(cè)定方法。方法： 用PEG400-2偏磷酸沉淀血漿蛋白,離心后取上清液進(jìn)行色譜分析。色譜柱為Diamosil-C18,流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（2575,V/V）,流速為1 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。結(jié)果: 黃芩苷的質(zhì)量濃度在0.087 222.907 5 mg/L （r=0.989 9）；低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品的相對(duì)回收率分別為96.3%、97.3%和96.6%。結(jié)論: 方法簡(jiǎn)便快速,適用于黃芩苷的血藥濃度測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究。 【關(guān)鍵詞】  黃芩甙； 色譜法，高壓液相； 血漿； 免Abstract Objective: To establis

3、h a biopharmaceutical analytical method for the determination of baicalin in plasma by RP-HPLC. Methods: Rabbit plasma proteins were precipitated with PEG400-2%metaphosphoric acid and the supernatant liquid obtained from the serum by centrifuge was subjected to chromatographic analysis. The analytic

4、al column was Eclipse XDB-C18, and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid （2575, V/V） with a flow rate of 1ml/min. The detection wavelength was 275 nm. Results：The linear range of baicalin in rabbit plasma was 0.087 222.907 5 mg/L （r=0.989 9）.Three relative recoveries of bai

5、calin represented low, middle and high concentrations were 96.3，97.3and 96.6 respectively. Conclusion: This method is accurate, reliable and simple and is suitable for the pharmacokinetic study of blood concentration of baicalin.Key words baicalin; chromatography,high pressure liquid; plasma; rabbit

6、s    黃芩為唇形科多年生草本植物黃芩的根，主要含有黃芩苷、黃芩素等多種黃酮類(lèi)化合物1。黃芩苷作為黃芩的主要有效成分之一，屬葡萄糖醛酸苷類(lèi),具有廣泛的藥理作用，除傳統(tǒng)意義上的抗炎、抗變態(tài)、抗病毒以及解熱和保肝作用外,近年來(lái),黃芩苷新用途的開(kāi)發(fā)與研究日漸深入2。黃芩苷具有清除氧自由基、減輕組織缺血再灌注損傷、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抗腫瘤等多方面的作用3。黃芩苷具有多種藥理活性，在中藥中的應(yīng)用非常廣泛，用量也特別的大，但相關(guān)報(bào)道其生物利用度較低4。因此，在傳統(tǒng)種植、提取及含量測(cè)定研究的同時(shí)，建立黃芩苷的血藥濃度測(cè)定方法，研究其體內(nèi)代謝過(guò)程，具有十分重要的基礎(chǔ)和臨床意義。2

7、007年4月對(duì)兔血漿中黃芩苷的含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，并測(cè)定了灌胃后家兔體內(nèi)黃芩苷濃度，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的藥代動(dòng)力學(xué)分析。1  儀器與試藥Agilent1100系列高效液相色譜儀（四元泵、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、化學(xué)工作站B.01.01C版），TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；黃芩提取物（含黃芩苷90%，四川省玉鑫藥業(yè)有限公司），黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110715-200514）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用兔由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱: Diamosil-C18

8、 （250 mm×4.6 mm,5 m），Phenomenex-C18保護(hù)柱（3 mm×4.6 mm,5 m）；流動(dòng)相：乙腈-0.1磷酸（2575，V/V）；流速:1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；柱溫:40 ;進(jìn)樣量:50 l。2.2  血漿樣本處理取待測(cè)血漿0.2 ml,加入PEG400 0.2 ml,2%的偏磷酸0.2 ml，渦旋混合30 s沉淀蛋白,高速離心（16 000 r/min）10 min,取上清液50 l進(jìn)樣測(cè)定。2.3  檢測(cè)限在2.1的色譜條件下,樣品按上述方法操作，得黃芩苷的最低檢測(cè)濃度為0.029 08 mg/L（S/N

9、3）。2.4  方法專(zhuān)一性在2.1的色譜條件下,樣品按上述方法操作,比較空白血漿，空白血漿加黃芩苷對(duì)照品、血漿樣品,考察方法的專(zhuān)一性。結(jié)果見(jiàn)圖1。2.5  標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制   精密吸取空白血漿0.2 ml，分別加入標(biāo)準(zhǔn)系列的黃芩苷對(duì)照品溶液，按血漿樣品的處理方法操作，制成相當(dāng)于黃芩苷濃度為0.087 22 mg/L、0.145 4 mg/L、0.290 8 mg/L、0.581 5 mg/L、1.163 mg/L、2.907 5 mg/L的血漿溶液，進(jìn)樣50 l測(cè)定。將黃芩苷峰面積（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行回歸，得直線(xiàn)回歸方程為：A=60.952 37

10、15;C3.982 52，r=0.998 9。由此可表明該方法在0.0872.900 mg/L濃度線(xiàn)性關(guān)系良好。     10-02-07 09:52:00     編輯：studa202.6  回收率試驗(yàn)    取空白血漿200 l,按“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)”條件項(xiàng)下方法配成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（分別為0.087 22 mg/L、0.290 8 mg/L、2.908 mg/L）的QC樣品各3份, 按樣品處理方法處理后進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)配制相同濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。與血漿

11、樣品結(jié)果對(duì)比，得到低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品的相對(duì)回收率，分別為96.3、97.3和96.6。2.7  精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度：配制含黃芩苷濃度為0.087 22、0.290 8和2.908 mg/L的QC樣品各3份，在同一天內(nèi)進(jìn)行樣品的處理和測(cè)定，得3個(gè)濃度QC樣品的RSD，分別為2.37%、1.04%和0.92%。日間精密度：按上法配制QC樣品各3份，在3 d中進(jìn)行相同的處理和測(cè)定，得3個(gè)濃度QC樣品的RSD，分別為5.86、3.92和2.58。2.8  穩(wěn)定性試驗(yàn)上述樣品于回收率試驗(yàn)后，放置于4 冰箱，10 d后復(fù)測(cè)，色譜峰面積變化不大，可見(jiàn)血漿樣品10 d內(nèi)在4 條

12、件下穩(wěn)定。2.9  血藥濃度測(cè)定健康家兔3只,經(jīng)灌胃予黃芩提取物90 mg/kg，給藥后0.083、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h定時(shí)靜脈取血0.5 ml。分離血漿,取0.2 ml血漿按“血漿樣品處理”條下操作,測(cè)定黃芩苷含量（見(jiàn)圖2）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用3P87藥代動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行曲線(xiàn)擬合,權(quán)重因子為1/C2（C為血藥濃度）,所得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。表1  黃芩苷的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（略）注：C為血藥濃度，AUC為血藥濃度曲線(xiàn)下面積3  討論3.1  流動(dòng)相溶劑的選擇在0.4%磷酸-甲醇系統(tǒng)中，空白血漿

13、的背景影響大于0.1%磷酸-乙腈的系統(tǒng)影響。同時(shí)以0.4%磷酸和0.1%磷酸對(duì)黃芩苷峰型的影響無(wú)明顯區(qū)別，而0.1%磷酸-乙腈系統(tǒng)的pH值在5左右， 0.4%磷酸-乙腈pH值在3左右，用0.1%磷酸-乙腈系統(tǒng)更有益于色譜柱的保護(hù)，因此，選用0.1%磷酸-乙腈系統(tǒng)做為生物樣品中黃芩苷分析的洗脫系統(tǒng)5。3.2  兔血漿中蛋白質(zhì)的處理考慮到樣品處理的簡(jiǎn)便、快速，首先選用蛋白質(zhì)沉淀法，選取過(guò)甲醇、乙腈、丙酮、中性鹽和加熱沉淀法，均不能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求6，7。偏磷酸是一種酸性沉淀劑，其作用機(jī)制是使蛋白質(zhì)分子的陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀。實(shí)驗(yàn)選取1%、2%、5%的偏磷酸做為蛋白質(zhì)沉淀劑，比較后發(fā)現(xiàn)用偏磷酸沉淀蛋白，黃芩苷的峰型很好，理論塔板數(shù)較高，但樣品的絕對(duì)回收率很低，且隨著偏磷酸的濃度增高，絕對(duì)回收率逐漸降低。通過(guò)先加入PEG400再加入偏磷酸沉淀蛋白質(zhì)的方法可改善黃芩苷的回收率，使其符合要求。4 【參考文獻(xiàn)】  1馬愛(ài)團(tuán)，鐘秀會(huì)，蒙立根.黃芩黃酮藥理研究概況J.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2006（42）：39-40.2陳秀清,齊香君,何恩銘.中藥黃芩研究新進(jìn)展J.食品與藥品,2006（8）:23-27.3高中紅，黃開(kāi)勛，許輝碧.黃芩黃酮對(duì)自由基的清除作用的ESR研究J.華中理工大