多角度激光光散射與GPC聯(lián)接與應用技術

1、63006300HollisterArenueSantaSantaBarbara.CA93117CA93117TEL(8O5)68V9C09TEL(8O5)68V9C09FAX(S05J6813123FAX(S05J6813123,att-ooni,att-ooni. .URLhttp;/ww*r.wyattcoHiURLhttp;/ww*r.wyattcoHi多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀聯(lián)接與應用技術MALLS/GPC(SEC)WYATTTECHNOLOGYCORPORTION(BEIJINGOFFICE)地址：北京西直門北大街58號金暉嘉園7-2302美國懷雅特技術公司北京代表處郵編：

2、100082電話：8610-82292806傳真：8610-82290337CORPORATIONCORPORATION多角度激光光散射與凝膠滲透色譜儀的聯(lián)接與應用WYATTTECHNOLOGYCORPORATION.一前言近十幾年來，光散射技術(Lightscattering)在高分子特征分析領域的應用得到了迅速的發(fā)展。將光散射技術和凝膠滲透色譜(GelPermeationChromatography,GPC或尺寸排阻色譜(SizeExclusionChromatography)分離技術相結合，不但可以測得大分子的絕對分子量，分子旋轉半徑與第二維里系數(shù)，還可測得分子量分布，分辨分子量大小不同

3、的族群以及分子的形狀，分枝率及聚集態(tài)等。目前，該技術已成為一種非常有效的工具，在美國，日本及歐洲已廣為使用，國內近年來亦引進了此項技術。二光散射簡介早在十九世紀初，人們就開始對光散射原理進行研究。自六十年代激光被發(fā)明以來，光散射的原理與技術使得以迅速發(fā)展，至今已成為檢測微小粒子形狀，粒徑大小，分子量，界面電位及粒子間效應的重要工具。隨著電腦技術的日新月異，許多過去需花費數(shù)小時甚至數(shù)日才能完成的實驗，如今只需數(shù)分鐘即可完成，而其準確性及重現(xiàn)性也大幅度提高了。光散射現(xiàn)象，如圖1所示，當一束光通過一間充滿煙霧的房間就會產生散射。利用在不同角度，不同時間所測得的光散射強度，再借助各種光學理論及軟件，硬

4、件設備，就可以測得微粒的許多特性。入射光散射光圖1光散射現(xiàn)象在光散射發(fā)展的歷程中，以下是一些具有代表性的人物:JamesClerkMaxwell(1833-1879)解釋了光是一種電磁波，并正確地計算出光的速度。LordRayleigh(1842-1919)文案大全研究了遠小于波長的微粒散射現(xiàn)象， 發(fā)現(xiàn)了散射強度與波長的四次方成反比， 并解釋了藍天被太陽光穿透大氣層所產生的散射現(xiàn)象。AbertEinstein(1879-1955)研究了液體的光散射現(xiàn)象。AChandrasekharaV.Raman(1888-1970)印度籍物理大師，提出了Raman效應，具著作多次發(fā)表于印度文期刊，直至第二次

5、世界大戰(zhàn)結束后才逐漸被人所知。PeterDebye(1884-1966)延續(xù)了Einstein的理論，描述了分子溶解于溶劑中所產生的光散射現(xiàn)象，提出用Debyeplot,求得重量平均分子量Mw三光散射理論激光照射到樣品時，會在各個方向產生散射光，于是我們可以在一個角度或多個角度收集散射光的強度。1 .光散射所透露的信息在任何方向的光散射強度與分子量和溶液的濃度成正比； 散射光角度的變化與分子的尺寸大小有關。當分子小于10nm時，各個角度的散射強度都相同；當分子介于10至30nm時，散射強度則由低角度向高角度呈直線下降的趨勢；而當分子大于30nm時，散射強度則隨角度增大呈曲線下降的趨勢。2 .基

6、本理論由Maxwell,Einstein,Debye及Zimm等人陸續(xù)發(fā)展起來，有關溶劑中分子量的光散射現(xiàn)象可由下列公式表達：K*c1=+2A2cR(DMwPG(1)式中：常數(shù)k=4兀2(dn/dc)2n02(NA入04)n。是溶劑的折光指數(shù)。C是溶質分子的濃度(g/mol)。NA是阿佛加德羅常數(shù)。入。是入射光的波長。DN/DC是溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質濃度變化的溶液折光指數(shù)變化。R()是單個角度的散射光(大于溶劑的散射光數(shù)量)除以入射光強度所得的分數(shù)即不同角度光散射強度。Mwll重均分子量。A是第二維里系數(shù)P(是光散射強度的函數(shù)將已代入式()展開得:在上式中，R()是測得值

7、，K*c、入0、為輸入值，均為已知值？而MwMrg為未知值。3.ZimmPlot將K*C/Re對sin2(q/2)+kc作圖，可得到著名的Zimm曲線，如圖2所示，其中K為調整橫坐標的設定值。圖2ZimmPlo當8一。時，(2)式簡化為斜率即是AK*=-1+2A2cR(0)M當8一O,C-0,(2)式簡化為K*1R(0)M在縱座標上交點的倒數(shù)即為Mw實驗的方法為配制一組不同濃度的溶液， 依次在不同的角度測量其散射光強度，由計算機程序按照上列的公式繪出ZimmPlot,并求得Mw的2及A值，這是極少數(shù)能直接測得絕對分子量的方法之一。但由于結果僅為單一平均值，I6r當C-0時，(2)式簡化為斜率是

8、rg2sin(0/2)+kc因此較適用于成分單一，分布較窄的分子，對于分布較寬或有不同族群分布的樣品，則較難看出全貌。四光散射與GPC/SECGPC/SE3以將溶劑中的分子按重量或尺寸大小依次洗脫出來。利用此項技術將光散射儀器與GPC/SECM用，除了可以分出不同的族裙，還可測得不同族群的分布，并且不需要另外標準樣品做標準曲線。 由于光散射信號直接與分子量大小有關， 因此可以直接測出重均絕對分子量，并獲得其它許多有關的信息。錯誤！2.010.012.014.016.0Volume(mL)圖4光散射強度與GPC!析圖18.020.05050505011oo11oorpcnveDVO9XUAChr

9、omatographywithLSSet-upPumpOColumnsColumnsPlumbingElectricalFilterInjectorDAWN-EOSorminiDAWNDAWN-EOSorminiDAWN圖5光散射強度與GPC/SEO用1Debyeplot通常GPC/SEC勺樣品注射濃度就很低，再經過色譜柱得到進一步的稀釋，圖4中光散射信號上的任何一點，其濃度都極低(趨近于零)。根據(jù)公式，當2A2c-0,將K*C/Re對sin2(q/2)+kc作圖6,其縱坐標交點即為1/Mw,由直線的斜率可得到入2,圖4光散射信號的每點都可以得到上述結果，由此可以求得分子量及旋轉半徑八2的分布

10、，如圖7所示：圖6Debyeplot*HEPARIN211.5圖7分子量對洗脫體積作圖logr* *LT1LT1L LT2T2LT3LT3LT4LT41.0 x101.0 x103 31.0 xl01.0 xl0J J1.0 x101.0 x10s s1.0 x1051.0X101.0 x1051.0X107 7MolarMass(g/mol)MolarMass(g/mol)圖8積分分子量2分子形狀不論是分布較寬或是多峰分布的樣品， 皆可通過測量分子量及分子旋轉半徑得到分子形狀的數(shù)據(jù)。球形分子門300MTogri=k+1/3logM無規(guī)則線團狀分子ri200MTogm=k+1/2logM棒狀分

11、子ri100M-10gri=k+1/1logM將10gri,logM作圖，有直線的斜率可以獲知分子的形狀，如圖9所示:CumulativeMolarMassCumulativeMolarMassM匚口君ELTH6一S焉0.5-0.6)圖9-1M、rg與分子形狀的關系MolarMass(g/mol)9-2構型判斷，rg對MW作圖。斜率為0.54土0.01。表明分子是具有無規(guī)則線團構象的線性聚合RMSRadiusvs.MolarMassGATC2_010.54?0.011.0 x1041.0 x1051.0 x1061.0 x107100.0RMSRadiusvs.MolarMassGATD401

12、0.68?0.04GATD5010.69?0.041.0 x1061.0 x10MolarMass(g/mol)1.0 x106MolarMass(g/mol)9-3構型判斷，rg對MW作圖。斜率大于0.6,表明分子具有伸展結構。斜率為1.0,表明是棒狀100.0RMSRadiusvs.MolarMassGATE20110.01.0 x101.0 x10_51.0 x1051.0 x104圖9-4構型判斷，rg對MW作圖。其U型曲線表明為典型的高支化度結構。3需要量多少個角度在低角度的時候，有雜質所產生的噪音信號干擾會很大，如圖10所示，所以只取低角度，加上九十度兩個角度，其誤差就會相對很大；

13、若只取九十度則只能求得分子量，無法測得旋轉半徑，所以最起碼要加上一組高角度來修正，則誤差會較少很多。4光散射儀器最基本的儀器miniDAWTREOS口圖11所示，在與入射光成45度、90度、135度角配置三組光電二極管檢測器，同時檢測不同角度的光散射強度，而激光經由樣品槽的毛細管通道，樣品槽為石英材質。如果要增加測量角度，可以如DAWNHELEOS在樣品槽的兩側以不對稱得方式增加檢測器的數(shù)目，如圖12所示可高達18個角度之多。五應用光散射強度與分子的大小及分子量有直接的關系，而SEC/GPCt分離不同尺寸及分子量的分子，結合此兩種特性，可以得到許多有用的信息，并廣泛地應用于高分子，生化及動力學

14、等研究領域。圖11三個檢測角度0scatteringangle、圖10雜質較多的GPC層析圖SolventSolventGlassCellGlassCell6rObservedangle圖12十八角度檢測器1高分子聚合物特性(Multi-AngleLaserLightScattering_MALLS合SEC/GPC不必依賴泵的流速，校正曲線及其它任何的假設，即可直接求得重均絕對MALLSPJ用色譜柱分離出的樣品在各個角度的光散射量（如圖13）,由RI檢測器得到的洗脫液濃度及dn/dc值，即可計算出各個切片的分子量。MALLSW得絕對分子量所需的各種物性均可由實驗直接求得，無需作任何假設。而GP

15、C的色譜柱又有分離雜質的功能，可以避免傳統(tǒng)的光散射需極小心準備樣品的麻煩。圖14顯示高分子混合物經SE3離后MALLSSRI的洗脫體積對照圖。由此圖看出RI對大分子量濃度低的物質較不敏感，而對低分子量高濃度者較敏感。利用多角度激光光散射系統(tǒng)分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。MAT1:3DPlot圖13光散射強度，洗脫體積與角度作圖OLD-4JO3R1MJC1OLD-4JO3R1MJC11010口VcAumeVcAume：mLmL）圖14這是由ASTR儆件得到的miniDAWN（上）和Optilab示差檢測器（下）信號。JnJnJ JMaMaStripZhinrtStripZhinrt- -RfEIRT

16、ARfEIRTA口e6-1。a口2 .蛋白質及其聚合體在各種工業(yè)應用中，決定蛋白質的絕對特性不僅嚴格而且必要，例如在生化工程應用上，以蛋白質為基質的產品必須很純而且無任何聚集存在。而測定蛋白質的分子量和是否有聚集態(tài)存在，光散射法是最理想的工具之一。以往， 在水相中用低角度光散射測量法 （LALLS受到溶劑中不純的物質干擾相當大。 而MALLS的多角度測量大大降低了背景噪音的干擾，并能提供完整的信息和良好的重現(xiàn)性結果。圖16顯示蛋白質混合物的MALLS和RI的信號。樣品在0.1MNaCl中含0.05M的磷酸鹽緩沖液中進行RI為WyattOptilab903,流速為0.1mL/min,色譜柱為Sh

17、odexKW-803和KW-804雖然此樣品為標準樣品，但MALLS5很清楚地檢測到聚集現(xiàn)象，此現(xiàn)象在RI幾乎無法辨認。3 .分枝高分子聚合物的分枝程度和分布是影響其物理和化學性質的一個重要因素。采用多角度激光光散射系統(tǒng)（MALLS與GPC/SEC（統(tǒng)聯(lián)用是唯一決定分枝系數(shù)gM的方法。IOM-1IOM-1O1 1OMIQOMIQ&,O10.012.0圖15分子量對洗脫體積圖，有四個明顯的峰1BSA67,00064,3007001%23緩激肽1,0601,090+102%4溶解酵素14,30014,600+3001%亮氨酸腦啡肽556592+63%C口口r111KMMnqq-J一1-11

18、雖然也有其他確定分枝的方法，但都不能直接且需要眾多假設及“虛擬因子”。由傳統(tǒng)的RI或Viscometer（粘度檢測器）測定的高枝化分子的分子量與絕對值有很大的差別，若欲做有效的色譜柱校正，則需以一系列與待測物成分相同的標準品作校正。若標準樣品與待測物的成分或組分不同，則會產生很大的誤差。例如分子量相同的球形高分子的洗脫時間比無規(guī)則線團狀分子要長。因為MALL斫求得分子量和大小為絕對值， 因此計算分枝系數(shù)gM不需要任何假設,由MALLSft接所求得的分子大小會直接影響分枝率。對分子量相同的長鏈狀分子而言，其值越小，則分枝程度越大。分枝比的定義為分枝分子的旋轉半徑與長鏈分子的旋轉半徑之比，即gM=

19、b/i由MALLSW得。圖17為由MALLSM得的分枝狀和長鏈形的高分子（PS）的旋轉半徑和分子量對照圖。由圖中可看出，雖然其分子量相同，但分布明顯不同。圖18為rg對Mw做圖。1x1O1x1OT T1x1O1x1O5 51x1Q1x1Qs sMotecularWejghtMotecularWejght圖17PS線形與枝化分子的對照圖圖18旋轉半徑對分子量圖（分子構型圖），可以看出樣品（藻酸鈉）在輻射后分子構型的變化。6 .動力學/反應速率MALLS5可以用于如抗原，抗體等反應迅速的溶液系統(tǒng)，粒子和蛋白質聚集現(xiàn)象的檢測。因為MALLS內部同時裝有數(shù)個固定的檢測器，所以不需移動任何儀器硬件來掃描

20、樣品，即可及時多方位同時捕捉反應速率的現(xiàn)象。使用MALLS可研究抗原-抗體反應，反應發(fā)生時就可決定聚集粒子的大小。當改變溫度，濃度或催化劑時，MALLST記錄下反應發(fā)生時，分子的特殊變化。圖19濃度變化對蛋白聚集的影響使用DAWN僉測器研究了濃度對分子量為75KD單分子蛋白質聚集作用的影響。 圖19描述了這種特殊蛋白質從30ug/ml至U1mg/ml范圍內得到的濃度相關性。如圖所示，該蛋白質在低濃度作為單一分子而在濃度大于700ug/ml時聚集為六聚體。該結果與由gluteraldehyde高度交聯(lián)技術所得結合完全相符。ProteinMassvs.ConcentrationO0.20.4oe0.81O0.20.4oe0.81ConcentrationConcentration（ing/mLing/mL圖20溫度變化對PMM份子量和大小的影響7.低分子量的測定DAW陽ELEO或miniDAWTREOS勺固定光電二極管檢測器可以捕捉到很微弱的光散射信號，使得分子量的測定成為可能。使用DAW陳列標準配制的任何一款激光器，都可以輕易地測量分子量低于2000D的聚合物，并具有相當?shù)臏蚀_性。由于DAWN