唑來膦酸聯(lián)合甲氨蝶呤對骨肉瘤細(xì)胞生長及化療敏感性研究

1、唑來膦酸聯(lián)合甲氨蝶呤對骨肉瘤細(xì)胞生長及化療敏感性研究         10-05-04 16:00:00     編輯：studa20             作者：龔海洋，蔡鄭東，鄭龍坡，李國東，華瑩奇【摘要】  目的 本試驗(yàn)主要觀察第3代二膦酸鹽類藥物唑來膦酸（zoledronic acid，ZOL）在體外對人骨肉瘤細(xì)胞株MG63生長的影響，進(jìn)

2、一步研究唑來膦酸與甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）合用對MG63細(xì)胞的生長抑制是否具有協(xié)同作用。方法 采用MTT法分別檢測不同劑量的唑來膦酸、甲氨蝶呤對人骨肉瘤細(xì)胞株MG63生長作用，檢測唑來膦酸聯(lián)合甲氨蝶呤對人骨肉瘤細(xì)胞株MG63的增殖抑制。結(jié)果唑來膦酸對MG63細(xì)胞的抑制效應(yīng)與藥物劑量及作用時間均成正比。單藥唑來膦酸組劑量為1、10 mol/L時，MG63細(xì)胞凋亡率分別為9.91%、48.95%，單用甲氨蝶呤（1、10、100 mgL）時細(xì)胞凋亡率為37.68%、45.93%、52.418%，當(dāng)唑來膦酸(10 mol/L)聯(lián)合甲氨蝶呤（1、10、100 mgL）時MG63細(xì)胞的

3、凋亡率分別為51.96%、66.77%、69.23%，聯(lián)合用藥組與單藥組相比差異有顯著性(P<0.01)。唑來膦酸作用MG63細(xì)胞72 h的IC50值為9.39 mol/L。結(jié)論唑來膦酸對人骨肉瘤細(xì)胞株MG63有生長抑制作用，呈時間、劑量依賴性效應(yīng)，唑來膦酸與甲氨蝶呤有協(xié)同作用。 【關(guān)鍵詞】  骨肉瘤； MG63細(xì)胞系； 唑來膦酸； 甲氨蝶呤； 協(xié)同作用    Abstract: ObjectiveTo explore the possible interest of therapeutic approaches including nitroge

4、n-containing biphosphonate zoledronic acid using osteosarcoma cell lines MG63，and to investigate whether there is a synergism between zoledronic acid and methotrexate. MethodZoledronic acid alone or combined with methotrexate was used to treat human ostoesarcoma cells line MG63.The cell growth inhib

5、ition was assessed by MTT.ResultThere was a dose-dependent and time-dependent (1-100molL) inhibition of cell proliferation by zoledronic acid.IC50 value of zoledronic acid for therapy of MG63 after 72h was 9.39 mol/L.The cell growth inhibition rates of MG63 at 72 h was 48.95% in zoledronic acid (10

6、mol/L) group，and 37.68%,45.93% and 52.42% in methotrexate groups MTX（1,10 and 100 mgL）.When combined treatment of zoledronic acid (10mol/L) and methotrexate（1,10 and 100 mgL）was used，the cell growth inhibition rates were 51.96%,66.77% and 69.23%,respectively. The combination of zoledronic acid and m

7、ethotrexate demonstrated a synergistic effect. The differences were significant(P<0.01).ConclusionZoledronic acid has an explicit effect of inhibiting proliferation of MG-63 cells in a time-and dose-dependent manner.Its IC50 value is 9.39 mol/L. Zoledronic acid could induce apoptosis and has a sy

8、nergistic interaction with methotrexate.    Key  words：ostoeosarcoma；  MG63；  zoledronic acid；  methotrexate；  synergistic effect    骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性腫瘤，有效化療應(yīng)用以前，即使采取較為徹底的截肢術(shù)，其治愈率也從未超過20%。自從70年代實(shí)施化療以及新輔助化療的應(yīng)用以來，骨肉瘤的預(yù)后有了顯著的改善，5年生存率也相應(yīng)提高到50%80%。然而，骨

9、肉瘤的治療遠(yuǎn)未達(dá)到完善的程度。目前在化療方面仍存在的爭議問題是：最理想的藥物組合、給藥時機(jī)、給藥順序和途徑以及治療的時間。    二膦酸鹽是近年來研發(fā)的抗代謝性骨病的一類新藥，主要用于治療骨質(zhì)疏松癥、惡性腫瘤引起的高鈣血癥、骨痛癥等。除具有強(qiáng)大的抑制骨吸收功能外，二膦酸鹽的抗腫瘤作用也受到越來越多的重視。最近的研究表明：二膦酸鹽對于骨肉瘤細(xì)胞有抗腫瘤作用。為探索骨肉瘤化療的新方法，本試驗(yàn)觀察了唑來膦酸(ZOL)對骨肉瘤MG63細(xì)胞系生長的影響，并聯(lián)合骨肉瘤經(jīng)典化療藥物甲氨蝶呤（MTX），觀察唑來膦酸與甲氨蝶呤的協(xié)同作用。    1&#

10、160; 材料和方法    1.1  材料    人骨肉瘤細(xì)胞株MG63購自中國科學(xué)院。試劑：唑來膦酸、甲氨蝶呤為購自濟(jì)南日月化工有限公司的高純度原料藥；DMEM、胎牛血清購自美國Hyclone公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司；ELX800酶標(biāo)儀(BIO-Tekinstruments，美國)。    1.2  方法    1.2.1  唑來膦酸、甲氨蝶呤配制    1 mol/L的唑來膦酸母液濾過0.

11、22 m的過濾器，用DMEM培養(yǎng)基將唑來膦酸濾過液稀釋成1 molL、5 molL、10 molL、20 molL、50 molL、100 molL。1 g/L的甲氨蝶呤母液濾過0.22 m的過濾器，用DMEM培養(yǎng)基將濾過液稀釋成1 mgL、5 mgL、10 mgL、20 mgL、50 mgL、100 mgL。    1.2.2  細(xì)胞培養(yǎng)    MG63細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2、飽和濕度37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長，0.125%的胰蛋白酶消化傳代，13 d換液1次。  

12、;  1.2.3  MTT比色法    取對數(shù)生長期的MG63細(xì)胞按1×104孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加液量200 l，24 h后換液。設(shè)空白對照組(不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)、對照組(接種細(xì)胞，不加化療藥物)及實(shí)驗(yàn)組(唑來膦酸、甲氨蝶呤單藥組及聯(lián)合用藥組加不同濃度的干預(yù)藥物)，每組設(shè)3個復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)48 h、72 h、96 h后加入MTT試劑(5 g/L)20 l，空白對照組加入20 lPBS，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸出上清，每孔加DMSO 150 l，置水平搖床上搖10 min后，在酶聯(lián)免疫測定儀上選擇波長540 nm，空白對照孔

13、調(diào)零，測定各孔吸光度A。計算細(xì)胞生長的抑制率。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A平均值對照組A平均值)×100%。根據(jù)直線回歸法計算唑來膦酸作用于MG63細(xì)胞的IC50值。    1.2.4  統(tǒng)計學(xué)方法    用SPSS 12.0進(jìn)行處理.用卡方檢驗(yàn)來驗(yàn)證顯著性，P<0.01為差異有顯著性。    2  結(jié)果    2.1  唑來膦酸對人骨肉瘤MG63細(xì)胞系生長的抑制作用    正常人骨肉瘤MG63細(xì)胞系呈梭形或類圓形，貼壁生長。生長力旺盛。唑來膦酸(1、10 molL)處理72 h的MG63細(xì)胞梭形不明顯，有些細(xì)胞變得細(xì)長，有些細(xì)胞變得圓鈍；唑來膦酸20 mol/L處理的MG63細(xì)胞梭形消失。細(xì)胞核變小變形，胞漿明