大鼠反流性食管炎和BARRETT食管基因表達(dá)譜的比較醫(yī)學(xué)論文_醫(yī)藥學(xué)論文_41018

1、論文范文題目：大鼠反流性食管炎和Barrett食管基因表達(dá)譜的比擬醫(yī)學(xué)論文_醫(yī)藥學(xué)論文編輯：小小 程鵬，龔均，劉貴生，汪濤，常英【摘要】 目的: 研究Barrett食管BE和反流性食管炎(RE)組織基因表達(dá)譜的差異. 方法: 建立胃十二指腸混合食管反流SD大鼠動(dòng)物模型，用含有4096條雙點(diǎn)大鼠cDNA芯片分別比擬BE,RE和正常食管上皮NC mRNA表達(dá)情況. 結(jié)果: 芯片雜交差異表達(dá)在3倍以上的基因，RE和NC雜交芯片232項(xiàng)，其中表達(dá)上調(diào)的基因90條，表達(dá)下調(diào)的基因142條；BE和NC雜交芯片448項(xiàng)，其中表達(dá)上調(diào)的基因312條，表達(dá)下調(diào)的基因136條; 相對(duì)于RE，BE表達(dá)上調(diào)的基因21

2、4條，表達(dá)下調(diào)的基因86條. 結(jié)論: BE和RE在基因表達(dá)水平上存在差異. 【關(guān)鍵詞】 Barrett食管0引言近年來(lái)，食管腺癌esophageal adenocarcinoma, EA發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈增長(zhǎng)趨勢(shì),Barrett食管被認(rèn)為是其發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素備受關(guān)注. 但其機(jī)制尚不清楚. 我們應(yīng)用Miwa等(Int J Cancer, 1996, 67:260)方法建立胃十二指腸混合食管反流動(dòng)物模型，基因芯片技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察食管上皮過(guò)度暴露于胃十二指腸混合反流物中基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的改變，以期明確BE發(fā)生、開展為EA的分子生物學(xué)機(jī)制.1材料和方法1.1材料二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠120只，8 wk齡,

3、體質(zhì)量220±20g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF條件雌雄分籠飼養(yǎng). 大鼠雌雄配對(duì)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組90只，對(duì)照組30只，每組雌、雄各半. 用Miwa等方法建造十二指腸胃混合食管反流SD大鼠模型；設(shè)假手術(shù)組為對(duì)照組，開腹后游離食管下端迷走神經(jīng)后關(guān)腹. 術(shù)后40 wk取材，縱行剖開食管，觀察大體病變后，區(qū)分食管炎Barretts食管組織，將不同病變剪開. 然后每病變組織分別取0.2 cm×0.2 cm標(biāo)本，40 g/L甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察各種病變組織學(xué)特征. 其余局部與組織切片建立一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，快速別離上皮組織并于離體10 min內(nèi)液氮凍存. 根

4、據(jù)病理結(jié)果將食管炎、Barretts食管組織分類存放，取對(duì)照組正常食管上皮作為對(duì)照normal control, NC，保證每種組織純度>80%，以備基因芯片檢測(cè).1.2方法cDNA芯片所用的4096個(gè)大鼠靶基因cDNA克隆由上海博星基因提供,以通用PCR引物擴(kuò)增，PCR反響及產(chǎn)物純化用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)控PCR質(zhì)量. 靶基因溶解于3×SSC點(diǎn)樣液中，用Cartesian7500點(diǎn)樣儀點(diǎn)于硅烷化玻片上，每個(gè)靶基因重復(fù)2點(diǎn). 點(diǎn)樣后玻片經(jīng)2 h水合，室溫枯燥0.5 h，置于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián)，再分別用2 g/L SDS，水及2 g/L硼氫化鈉溶液處理10 min，晾干備

5、用. 探針制備采用Chomczynski提出的一步法從上述組織中抽提總RNA, 用Oligotex mRNA Midi Kit(qiagen) 純化mRNA,逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化. 參照Schena等Proc Natl Acad Sci USA, 1996，93: 10614的方法逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記探針并純化，用Cy5dUTP標(biāo)記食管炎、Barrett食管組織樣本cDNA, Cy3dTUP標(biāo)記對(duì)照組食管組織作為對(duì)照cDNA. 乙醇沉淀后溶解在20 L, 5×SSC加2 g/L SDS的雜交液中. 將雜交探針和基因芯片分別在95水浴中變性5 min, 將探針參加基因芯片上,用蓋玻片封片

6、,置于60雜交1517 h. 翻開蓋玻片,分別用2×SSC加2 g/L SDS, 0.1×SSC加2 g/L SDS的溶液洗滌10min,室溫晾干. 采用General Scanning公司的Scan Array 3000掃描芯片, 用預(yù)先選定的內(nèi)參照基因Cy3和Cy5進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，雜交結(jié)果顯示：全部陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)清楚，陰性對(duì)照信號(hào)很弱，證明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠. 用Gene Pix Pro 3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號(hào)的比值, 用40個(gè)持家基因進(jìn)行Cy3和Cy5的均衡，并對(duì)Cy3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理得出Cy3*，計(jì)算Cy5/Cy3*兩者的比值用于異常表達(dá)判斷. 判定基因差異

7、表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)定為: Cy5和Cy3*的比值ratio大于3.0或小于0.33; 有效基因的Cy3*和Cy5的值兩者皆大于200或其一大于800；PCR結(jié)果良好.2結(jié)果2.1基因芯片雜交信號(hào)散點(diǎn)圖NC,BE,RE組織總RNA的A260/A280值為22.6，電泳結(jié)果證實(shí)，抽提到高純度總RNA. 差異表達(dá)基因篩選,以Cy3與Cy5的熒光信號(hào)值作散點(diǎn)圖，X軸、Y軸分別以Cy3熒光信號(hào)值=前景值-背景值和Cy5的熒光信號(hào)值為坐標(biāo)，每一數(shù)據(jù)點(diǎn)代表芯片上一個(gè)基因點(diǎn)的雜交信號(hào)，顯示一個(gè)很分散的分布圖形，大局部聚集在幾乎為45度的對(duì)角線周圍的紅點(diǎn)代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之間，屬于非差異性表達(dá)；數(shù)據(jù)

8、點(diǎn)為黃色，代表Y值和X值的比值在0.33至3.0之外，屬于差異性表達(dá).2.2基因芯片雜交熒光掃描圖基因芯片雜交差異表達(dá)顯著性在3倍以上的的基因，其中RE和NC雜交芯片232項(xiàng)，其中表達(dá)上調(diào)的基因90條，表達(dá)下調(diào)的基因142條；BE和NC雜交芯片448項(xiàng)，其中表達(dá)上調(diào)的基因312條，表達(dá)下調(diào)的基因136條. BE,RE與NC比擬所有差異性表達(dá)的基因去除BE,RE共同差異性表達(dá)的基因?yàn)锽E與RE比擬差異性表達(dá)的基因，共300條，上調(diào)表達(dá)的基因214條，表達(dá)下調(diào)的基因86條,這些基因按功能分成12大類 . BE與RE比擬表達(dá)差異3倍以上的局部基因(表1，2).表1BE與RE表達(dá)差異3倍的基因功能分類

9、略表2BE與RE比擬表達(dá)差異3倍以上的局部基因略3討論BE與EA關(guān)系密切，BE每年發(fā)生EA的危險(xiǎn)性增加0.5%，是EA的癌前病變. 賁門腺癌和EA發(fā)病年齡、性別、臨床、病理特征等多方面相似，組織起源可能相同，傾向于將賁門腺癌和EA統(tǒng)稱為胃食管連接部腺癌1. 我們應(yīng)用Miwa等的方法建立胃十二指腸混合食管反流動(dòng)物模型，利用基因芯片觀察食管粘膜上皮過(guò)度暴露于胃十二指腸內(nèi)容物中基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)改變. 國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道. 上調(diào)表達(dá)基因中，連接黏附分子1、白血病胞質(zhì)磷酸蛋白、谷胱苷肽合成酶、KAI1、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)素和S100鈣結(jié)合蛋白等與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān). 其中交聯(lián)黏附分子1具有介導(dǎo)有害物質(zhì)損傷

10、消化道上皮細(xì)胞的作用2, BE高表達(dá)提示其可能介導(dǎo)胃十二指腸有害內(nèi)容物引起的食管上皮損傷. 谷胱苷肽合成酶過(guò)度表達(dá)有抑制細(xì)胞凋亡的作用3. KAI1與腫瘤的早期發(fā)生有關(guān),細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)素與腫瘤進(jìn)展有關(guān)4，高表達(dá)說(shuō)明BE細(xì)胞較RE細(xì)胞有惡變傾向. 血液結(jié)合素與腫瘤的侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)5. S100鈣結(jié)合蛋白與腺上皮來(lái)源的惡性腫瘤的分化有關(guān)6. 下調(diào)表達(dá)的基因中基質(zhì)金屬蛋白2、蛋白酪氨酸磷酸酶、金屬蛋白酶組織抑制因子3、CD36抗原、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子刺激克隆22和BCL2/腺病毒E1B 19 ku作用蛋白3均有抑制腫瘤發(fā)生的作用，說(shuō)明食管上皮受胃十二指腸內(nèi)容物的過(guò)度刺激開展為BE，抑制腫瘤發(fā)生的能力下降.

11、其中基質(zhì)金屬蛋白2低表達(dá)是腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要的必要條件之一7. 蛋白酪氨酸磷酸酶為抑癌基因8. 金屬蛋白酶組織抑制因子3抑制金屬蛋白酶樣蛋白，后者是重要的與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)的酶，大多數(shù)腫瘤組織兩者呈相反的表達(dá)趨勢(shì)，前者低表達(dá)，后者高表達(dá)9. CD36抗原是血小板反響素的配體，兩者結(jié)合后產(chǎn)生抑制腫瘤血管生成的效應(yīng)，多種腫瘤組織低表達(dá)10. 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 刺激克隆22誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞多呈低表達(dá)11. BCL2/腺病毒E1B 19 ku作用蛋白3是凋亡誘導(dǎo)蛋白，抑制腫瘤發(fā)生，在腫瘤組織中通常低表達(dá). 上述多數(shù)差異表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)基因說(shuō)明BE可能通過(guò)不同環(huán)節(jié)向腫瘤方向演變，與同樣胃十二指

12、腸內(nèi)容物刺激下的RE在基因轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為完全不同的特征. 說(shuō)明BE發(fā)生是多基因參與的事件，有必要對(duì)不同基因相互協(xié)調(diào)作用機(jī)制進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1 Byrne JP, Mathers JM, Parry JM, et al. Site distribution of oesophagogastric cancer J. Clin Pathol, 2002，55(3): 191-194.2 Amieva MR, Vogelmann R, Covacci A, et al. Disruption of the epithelial apicaljunctional complex by Heli

13、cobacter pylori CagAJ. Science, 2003，300(5624): 1430-1434.3 Rudin CM, Yang Z, Schumaker LM, et al. Inhibition of glutathione synthesis reverses Bcl2mediated cisplatin resistance J. Cancer Res, 2003，63(2): 312-318.4 Mikami T, Ookawa K, Shimoyama T, et al. KAI1, CAR, and Smad4 expression in the progre

14、ssion of colorectal tumor J. J Gastroenterol, 2001，36(7): 465-469.5 Takino T, Miyamori H, Watanabe Y, et al. Membrane type 1 matrix metalloproteinase regulates collagendependent mitogenactivated protein/extracellular signalrelated kinase activation and cell migration J. Cancer Res, 2004，64(3):1044-1

15、049.6 Arai K, Teratani T, Nozawa R, et al. Immunohistochemical investigation of S100A9 expression in pulmonary adenocarcinoma: S100A9 expression is associated with tumor differentiation J. Oncol Rep, 2001，8(3): 591-596.7 Hao X, Sun B, Hu L,et al. Differential gene and protein expression in primary b

16、reast malignancies and their lymph node metastases as revealed by combined cDNA microarray and tissue microarray analysis J. Cancer, 2004，100(6): 1110-1122.8 Yamamoto Y, Irie K, Asada M, et al. Direct binding of the human homologue of the Drosophila disc large tumor suppressor gene to sevenpass tran

17、smembrane proteins, tumor endothelial marker 5 (TEM5), and a novel TEM5like protein J. Oncogene, 2004 Epub ahead of print.9 Karan D, Lin FC, Bryan M, et al. Expression of ADAMs (a disintegrin and metalloproteases) and TIMP3 (tissue inhibitor of metalloproteinase3) in human prostatic adenocarcinomas J. Int J Oncol, 2003，23 (5):1365-1371.10 Simantov R, Silverstein RL. C