PCR原理與操作ppt課件

1、生物變異的普遍性、變異與遺傳的關(guān)系，提出了生存競爭和自然選擇學(xué)說，系統(tǒng)地論述了物種形成的機制。1871年，達爾文又發(fā)表了人類的由來及其性選擇，描述了人類進化的過程。他的結(jié)論是：“人類和其他物種同是某一種古老、低級、早已滅絕了的生物類型的同時并存的子孫”。偉大革命導(dǎo)師馬克思對進化論給予了很高的評價，把它與能量守恒和轉(zhuǎn)換定律、細胞學(xué)說并列為19世紀的三大自然科學(xué)發(fā)現(xiàn)。 一、基因及一、基因及DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)二、二、DNADNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯三、三、PCRPCR原理原理四、四、PCRPCR操作操作一、基因及一、基因及DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu)1 1、基因（、基因（ge

2、negene）：）：遺傳因子，是遺傳因子，是DNADNA或或RNARNA分子上具分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列，基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)有遺傳信息的特定核苷酸序列，基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現(xiàn)。個體的性狀表現(xiàn)。2 2、基因概念的提出：、基因概念的提出：1919世紀世紀6060年代，遺傳學(xué)家孟年代，遺傳學(xué)家孟德爾提出了生物的性狀是由遺傳因子控制的觀點。德爾提出了生物的性狀是由遺傳因子控制的觀點。2020世紀初期，遺傳學(xué)家摩爾根通過果蠅的遺傳實驗，世紀初期，遺傳學(xué)家摩爾根通過果蠅的遺傳實驗，認識到基因存在

3、于染色體上，并且在染色體上是呈認識到基因存在于染色體上，并且在染色體上是呈線性排列，從而得出了染色體是基因載體的結(jié)論。線性排列，從而得出了染色體是基因載體的結(jié)論。 1865 1865年，孟德爾發(fā)表了年，孟德爾發(fā)表了植物雜交實驗植物雜交實驗，首次，首次闡述了生物界有規(guī)律的遺闡述了生物界有規(guī)律的遺傳現(xiàn)象。傳現(xiàn)象?！斑z傳因子遺傳因子” 19001900年，孟德爾遺傳規(guī)年，孟德爾遺傳規(guī)律被證實，成為近代遺傳律被證實，成為近代遺傳學(xué)基礎(chǔ)。學(xué)基礎(chǔ)。遺傳學(xué)是分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)3 3、DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出：雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出：19531953年，年，James Watson和和Francis Cric

4、k發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了DNADNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)，開雙螺旋的結(jié)構(gòu)，開啟了分子生物學(xué)時代，使遺傳的研究深入到分子層啟了分子生物學(xué)時代，使遺傳的研究深入到分子層次，次，“生命之謎生命之謎”被打開，人們清楚地了解遺傳信被打開，人們清楚地了解遺傳信息的構(gòu)成和傳遞的途徑。息的構(gòu)成和傳遞的途徑。19621962年，共同榮獲了諾貝年，共同榮獲了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。microRNA小分子RNANcRNA非編碼RNAtRNA & rRNA復(fù)制二、遺傳信二、遺傳信息的傳遞：息的傳遞：1 1、復(fù)制：、復(fù)制：是以母鏈是以母鏈DNADNA為模板合成子鏈為模板合成子鏈DNADNA的過程。的過程。實質(zhì)實質(zhì)

5、是在酶是在酶促作用下，單個的脫氧核苷酸通過促作用下，單個的脫氧核苷酸通過3 3，5 5- -磷酸二酯鍵聚合的過程。磷酸二酯鍵聚合的過程。在復(fù)制過程中，在復(fù)制過程中，DNADNA雙螺旋解開成為兩條單鏈雙螺旋解開成為兩條單鏈( (親代鏈親代鏈) )，以每一條，以每一條單鏈為模板，按照堿基配對規(guī)律，各自合成一條與之互補的新鏈單鏈為模板，按照堿基配對規(guī)律，各自合成一條與之互補的新鏈（子代鏈），形成兩個結(jié)構(gòu)和堿基序列完全一致的子代（子代鏈），形成兩個結(jié)構(gòu)和堿基序列完全一致的子代DNADNA，其中，其中每一個子代每一個子代DNADNA分子中都保留一條來自親代的鏈。分子中都保留一條來自親代的鏈。復(fù)制復(fù)制親代

6、親代DNA子代子代DNA（一）（一）DNADNA的復(fù)制：的復(fù)制：半保留復(fù)制半保留復(fù)制19581958年，年，Meselson Meselson 和和 Stahl Stahl 證明證明DNADNA半保留復(fù)制半保留復(fù)制Meselson-Stahl實驗(米西爾遜米西爾遜-斯塔爾實驗斯塔爾實驗 ) 被稱為“生物學(xué)中最漂亮的實驗 ”復(fù)復(fù)制制過過程程簡簡圖圖按半保留復(fù)制方式，子代按半保留復(fù)制方式，子代DNADNA與親代與親代DNADNA的堿基的堿基序列一致。序列一致。2 2、半保留復(fù)制的意義、半保留復(fù)制的意義 遺傳的保守。遺傳的保守。 物種的穩(wěn)定。物種的穩(wěn)定。 決定后代的生物學(xué)性狀和代謝類型。決定后代的生

7、物學(xué)性狀和代謝類型。（二）轉(zhuǎn)錄：（二）轉(zhuǎn)錄：RNARNA的生物合成的生物合成1 1、轉(zhuǎn)錄：、轉(zhuǎn)錄：生物體以生物體以DNADNA為模板合成為模板合成RNARNA的過程，即以雙鏈的過程，即以雙鏈DNADNA中中的一條鏈為模板，以的一條鏈為模板，以ATPATP、CTPCTP、GTPGTP和和UTP4UTP4種核苷三磷酸為原料，種核苷三磷酸為原料，在在RNARNA聚合酶催化下合成聚合酶催化下合成RNARNA的過程。是的過程。是mRNAmRNA、tRNAtRNA、rRNArRNA等的等的合成步驟，包括起始、延伸、終止合成步驟，包括起始、延伸、終止3 3個步驟。個步驟。 翻譯：翻譯：即蛋白質(zhì)的生物合成，是

8、將核酸即蛋白質(zhì)的生物合成，是將核酸RNA中密碼中密碼子破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中子破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的種氨基酸的排列順序排列順序 。翻譯過程從。翻譯過程從5 -AUG開始，按開始，按mRNA模板模板三聯(lián)體密碼的順序延長肽鏈，直至終止密碼出現(xiàn)。三聯(lián)體密碼的順序延長肽鏈，直至終止密碼出現(xiàn)。 （三）翻譯：（三）翻譯：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的生物合成的生物合成1 1、定義：聚合酶鏈反應(yīng)、定義：聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）是在是在DNADNA聚合酶催化下，聚合酶催化下，以母鏈以母鏈DNADNA為模板以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延為模板以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、

9、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNADNA互補的子鏈互補的子鏈DNADNA的過程。的過程。是一項是一項DNADNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的的DNADNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。多態(tài)性研究等許多方面。 三、三、PCRPCR原理原理 PCR PCR是是8080年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。l19531953年，年，Watson和和Crick提出提出DNADNA

10、雙螺旋結(jié)構(gòu)及雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制半保留復(fù)制模型。模型。l19581958年，年，Meselson和和Stahl用實驗證實用實驗證實DNADNA半保留復(fù)制模型。半保留復(fù)制模型。l7070年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體年代以來，人們采用兩種思路去嘗試建立基因的無性繁殖體系，一是系，一是基因克隆基因克隆技術(shù)，二是技術(shù)，二是體外擴增體外擴增技術(shù)。技術(shù)。l19711971年年，Khorana（美國，（美國，19681968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主）：年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主）：“經(jīng)經(jīng)過過DNADNA變性，與合適引物雜交，用變性，與合適引物雜交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不斷聚合酶延伸引

11、物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆重復(fù)該過程便可克隆tRNAtRNA基因?；颉！眑核酸體外擴增核酸體外擴增最早設(shè)想被遺忘原因最早設(shè)想被遺忘原因: :（1 1）很難進行測序和合成）很難進行測序和合成寡核苷酸引物；（寡核苷酸引物；（2 2）19701970年年SmithSmith等發(fā)現(xiàn)了等發(fā)現(xiàn)了IIII型限制性內(nèi)切酶，型限制性內(nèi)切酶，體外克隆基因已成為可能。體外克隆基因已成為可能。2 2、PCRPCR技術(shù)的發(fā)展歷程技術(shù)的發(fā)展歷程l19761976年，臺籍科學(xué)家錢嘉韻（年，臺籍科學(xué)家錢嘉韻（Alice Chien）從黃石國家公園）從黃石國家公園的嗜熱菌的嗜熱菌Thermus aquaticus中分離出對

12、熱穩(wěn)定的中分離出對熱穩(wěn)定的Taq DNA聚聚合酶合酶。l19851985年，美國年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的公司人類遺傳研究室的Mullis發(fā)明發(fā)明PCR，Saiki等首次應(yīng)用等首次應(yīng)用PCRPCR法成功地擴增了人法成功地擴增了人 - -珠蛋白的珠蛋白的DNADNA，并應(yīng)，并應(yīng)用于鐮刀狀紅細胞貧血的產(chǎn)前診斷。用于鐮刀狀紅細胞貧血的產(chǎn)前診斷。l19851985年，年，ScienceScience雜志報道了耐熱性雜志報道了耐熱性DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTaq酶（酶（生活在溫泉中的生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的內(nèi)提取到的一種耐熱的DNADNA聚合聚合酶）

13、，整個反應(yīng)只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改酶），整個反應(yīng)只加一次酶即可，擴增特異性和效率都明顯改善，操作大為簡化。此酶的發(fā)現(xiàn)善，操作大為簡化。此酶的發(fā)現(xiàn), ,預(yù)示著分子時代的到來。預(yù)示著分子時代的到來。l19891989年被譽為年被譽為“分子年分子年”，列，列PCRPCR為十余項發(fā)明之首。為十余項發(fā)明之首。l19931993年，年，MullisMullis榮獲諾貝爾化學(xué)獎。榮獲諾貝爾化學(xué)獎。3 3、PCRPCR的原理的原理l遺傳物質(zhì)：遺傳物質(zhì)：細胞核細胞核 染色體染色體 DNADNA（脫氧（脫氧核糖核酸、磷酸鏈和堿基構(gòu)成核糖核酸、磷酸鏈和堿基構(gòu)成) ) 堿基（堿基（A A、T T、C

14、C、G G）是按雙鏈螺旋排列的，）是按雙鏈螺旋排列的，堿基序列的長度和排列順序決定了生物的多堿基序列的長度和排列順序決定了生物的多樣性。樣性。lPCRPCR的基本工作原理：的基本工作原理：以擬擴以擬擴增的增的DNADNA分子為模板，以一對分分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在引物，在DNADNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機理沿著模板按照半保留復(fù)制的機理沿著模板鏈延伸直至完成新的鏈延伸直至完成新的DNADNA合成。合成。lPCRPCR反應(yīng)的基本成分：反應(yīng)的基本成分：模板模板DNADNA、特異性引物、特異性引物、熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DN

15、ADNA聚合酶、脫氧聚合酶、脫氧核苷三磷酸（核苷三磷酸（dNTPdNTP）、）、Mg2+Mg2+等。等。 基本反應(yīng)基本反應(yīng)步驟：步驟：變性變性-退火退火-延延伸，最后通過染料，如伸，最后通過染料，如EBEB染色染色DNADNA后在紫外燈下后在紫外燈下顯色檢出顯色檢出l變性溫度與時間：變性溫度與時間：一般一般93939494，1min1min足以使模板變性，若足以使模板變性，若低于低于9393則需延長時間，但溫度過高對酶的活性有影響。則需延長時間，但溫度過高對酶的活性有影響。l退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )溫度與時間：溫度與時間：取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，取決于引物的長度、堿基組成及其濃

16、度，還有靶基因序列的長度，對于還有靶基因序列的長度，對于2020個核苷酸，個核苷酸，G+CG+C含量約含量約50%50%的引物，的引物，5555作為選擇最適退火溫度的起點較為理想。作為選擇最適退火溫度的起點較為理想。 按下公式計算：按下公式計算：TmTm（解鏈溫度）（解鏈溫度）4(G+C)+2(A+T)4(G+C)+2(A+T)； 復(fù)性溫度復(fù)性溫度=Tm=Tm值（值（5 51010） 在在TmTm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCRPCR反應(yīng)的特異性。一般為反應(yīng)的特異性。一般為

17、303060s60s。 延伸溫度與時間：延伸溫度與時間： 延伸溫度：延伸溫度：一般選在一般選在70707575之間，之間，常用溫度為常用溫度為7272，過高的延過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 延伸反應(yīng)時間：延伸反應(yīng)時間： 1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min1min；3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min；擴增；擴增10kb10kb需延伸至需延伸至15min15min 延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增，但是對低濃度模板的擴延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增，但是對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。增，延

18、伸時間要稍長些。循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)決定循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度，主要取決于模板擴增程度，主要取決于模板DNA的濃度，一般選在的濃度，一般選在3040次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。產(chǎn)物的量亦隨之增多。1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1-3步25-35輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍 PCR PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進行，使DNADNA擴增量呈指數(shù)上升。反擴增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的應(yīng)最終的D

19、NA DNA 擴增量的計算：擴增量的計算： Y(1X)n Y Y代表代表DNADNA片段擴增后的拷貝數(shù)，片段擴增后的拷貝數(shù)，X X表示平表示平(Y)(Y)均每次的擴增效均每次的擴增效率，率，n n代表循環(huán)次數(shù)。代表循環(huán)次數(shù)。 平均擴增效率的理論值為平均擴增效率的理論值為100%100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達，但在實際反應(yīng)中平均效率達不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNADNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨片段的增加呈指數(shù)形式，隨著著PCRPCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的產(chǎn)物的逐漸積累，被擴增的DNADNA片段不再呈指數(shù)增加，而片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即

20、出現(xiàn)進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、平臺期數(shù)、PCRPCR擴增效率及擴增效率及DNADNA聚合酶聚合酶PCRPCR的種類和活性及非特異的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避性產(chǎn)物的竟爭等因素。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。免的。 5 5、PCRPCR的反應(yīng)動力學(xué)的反應(yīng)動力學(xué)PCRPCR反應(yīng)曲線反應(yīng)曲線6 6、標準的、標準的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系1010擴增緩沖液擴增緩沖液1010l l4 4種種dNTPdNTP混合物混合物各各200200mol/Lmol/L引物引物1010100pmol10

21、0pmol模板模板DNADNA0.10.12 2g gTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶2.5u2.5uMgMg2+2+ 1.5mmol/L 1.5mmol/L加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至100100l l7 7、PCRPCR產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測 將反應(yīng)產(chǎn)物取將反應(yīng)產(chǎn)物取3-83-8l l作作2.02.0瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳，定性定性檢測目的基因的擴增水平。檢測目的基因的擴增水平。四、四、PCRPCR反應(yīng)特點：反應(yīng)特點： 特異性強：特異性強：遵循堿基配對原則，忠實的復(fù)制模板鏈；遵循堿基配對原則，忠實的復(fù)制模板鏈； 靈敏度高：靈敏度高：指數(shù)方式增加的，能將指數(shù)方式增加的，能將pg (10-12 ) 量級的起始待測量級的起始待測模板擴增到模板擴增到ug (10-6)水平，可從水平，可從 100 萬個細胞中檢出一個靶細萬個細胞中檢出一個靶細胞；胞； 簡便、快速：簡便、快速：PCRPCR反應(yīng)用耐高溫的反應(yīng)用耐高溫的Taq DNATaq DNA聚合酶，一次性地聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在將反應(yīng)液加好后，即在DNADNA擴增液和水浴鍋上進行變性擴增液和水浴鍋上進行變性- -退火退火- -延延伸反應(yīng)，一般在伸反應(yīng)，一般在2-4h2-4h完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電