健脾化瘀清熱藥對大鼠胃潰瘍愈合質(zhì)量及其表皮生長因子受體mRN

1、健脾化瘀清熱藥對大鼠胃潰瘍愈合質(zhì)量及其表皮生長因子受體mRNA表達的影響         11-05-12 15:35:00     編輯：studa20                作者：張永鋒,吳正治,賈秀琴,譚永港,趙燕萍 【摘要】  目的 探討健脾化瘀清熱代表藥(黃芪、丹參、黃連)對胃潰瘍

2、愈合質(zhì)量(QOUH)的影響及作用機制。方法 采用大鼠乙酸胃潰瘍模型,觀察黃芪、丹參、黃連對該模型QOUH的影響；原位分子雜交法檢測表皮生長因子受體(EGFR)mRNA的表達。結(jié)果 黃芪、丹參、黃連均能改善胃黏膜組織的損傷,黃芪、丹參能增強潰瘍周圍組織EGFR mRNA的表達。結(jié)論 健脾化瘀清熱藥提高QOUH、增強潰瘍瘢痕處EGFR mRNA的表達可能是健脾化瘀藥的作用機制之一。 【關(guān)鍵詞】  胃潰瘍；健脾化瘀清熱藥；表皮生長因子；潰瘍愈合質(zhì)量；大鼠    Abstract：Objective To investigate the effect and m

3、echanism of invigorating spleen, eliminating stasis, heat-clearing drugs (milk veteh, root of red rooted salvia, Chinese goldthread) on quality of ulcer healing (QOUH). Methods The rat models of chronic gastric ulcer was induced by acetic acid, the effects of QOUH of milk veteh, root of red rooted s

4、alvia and Chinese goldthread on the model of gastric Ulcer were observed, the expression of EGFR mRNA of mucosa were measured by in situ hybridization. Results Milk veteh, root of red rooted salvia and Chinese goldthread could improve the injury of gastric mucosa. Milk veteh, root of red rooted salv

5、ia increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around peptic ulcer (PU). Conclusion Invigorating spleen, eliminating stasis, heat-clearing drugs can improve QOUH, it is one of possible mechanisms that the drugs increased the expression of EGFR mRNA in the tissue around PU.   

6、Key words：gastric ulcer；invigorating spleen, eliminating stasis, heat-clearing drugs；epidermal growth factor；quality of ulcer healing；rat    根據(jù)中醫(yī)理論,綜觀消化性潰瘍(peptic ulcer,PU)緩解期臨床治療的有關(guān)方藥,基本屬于健脾、化瘀、清熱范疇。本實驗通過觀察健脾化瘀清熱代表藥(黃芪、丹參、黃連)對大鼠胃潰瘍愈合質(zhì)量(quality of ulcer healing,QOUH)及其表皮生長因子受體(EGFR)mR

7、NA表達的影響,為中醫(yī)藥提高PU遠期療效提供思路與方法。1  實驗材料1.1  實驗動物    SD大鼠90只,雌性,體重180220 g,廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號：0028062。1.2  藥物與試劑    黃芪、丹參、黃連由深圳市第二人民醫(yī)院第一門診部中藥房提供,各單味藥物置于搪瓷藥罐中,以110比例加入蒸餾水浸泡2 h,加熱煮沸30 min,濾出頭煎,藥渣加蒸餾水適量,再煮沸30 min,濾出二煎,合并2次濾液,濃縮成200%,置冰箱中保存。西咪替丁片,江西制藥有限責任公司生產(chǎn),批號

8、990808-1。EGFR mRNA試劑盒,購自武漢博士德生物工程有限公司。1.3  儀器    顯微鏡測微尺(武漢光學儀器廠生產(chǎn)),原位雜交專用蓋玻片(博士德公司產(chǎn)品),雜交盒,S-HH-W型恒溫水浴箱(上海浦東躍欣科學儀器廠),SYQ-ZDX-35B型自動座式壓力蒸氣滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠),CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學),Nikon P-顯微攝影系統(tǒng)(日本)。2  實驗方法2.1  造模    參考文獻1方法。大鼠造模前24 h禁食不禁水。用20%烏拉坦4 mL/kg體重腹

9、腔注射麻醉。腹部備皮、消毒,于劍突下腹中線打開腹腔,手術(shù)切口長約2 cm,暴露出胃,在胃前壁漿膜面竇體交界處同一部位(避開血管)用浸有冰醋酸、直徑為5 mm的圓形濾紙接觸2次,每次30 s,然后還納胃體,逐層縫合切口,涂上一層稀釋的火棉膠,保護切口。2.2  分組與給藥    造模大鼠清醒后,完全隨機分為6組：正常對照組、模型對照組、西咪替丁組、黃芪組(健脾藥)、丹參組(化瘀藥)及黃連組(清熱藥),每組15只。于造模第6天開始灌胃,黃芪、丹參及黃連給藥劑量均為20 g/(kg?d),西咪替丁給藥劑量為67 mg/(kg?d),對照組予0.9% NaCl溶

10、液14.6 mL/(kg?d)。每天1次,共16 d。所有藥物溶液及0.9%NaCl溶液pH值均為7.0。于造模第22天斷頭處死大鼠,檢測指標及取材。2.3  標本的采集和處理    大鼠禁食不禁水24 h后斷頭處死,剖腹取胃,以潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心取材,8%甲醛固定,石蠟包埋,以瘢痕的最長徑為中心連續(xù)切片,間隔5 m,分別作蘇木素-伊紅(HE)染色和AB(pH 2.5)/PAS染色；取潰瘍瘢痕周圍組織一塊,4%多聚甲醛(含DEPC)固定、石蠟包埋、切片,原位分子雜交方法觀察EGFR mRNA的表達。2.4  觀察指標2.4.

11、1  再生黏膜厚度、黏膜肌層缺損寬度2 治療16 d后,藥物組肉眼見潰瘍基本愈合,在HE染色的連續(xù)切片上,用低倍鏡找到潰瘍愈合部位,在高倍鏡下觀察測量,用顯微鏡測微尺分別測5個視野長度,計算其平均值。2.4.2  表面黏液厚度2 在HE染色的切片上找到潰瘍愈合部位,在對應(yīng)的AB/PAS染色的切片上觀察,用測微尺分別測5個視野的表面黏液厚度,計算其平均值。2.4.3  表皮生長因子受體mRNA的表達 實驗步驟按試劑盒說明書操作,以細胞胞漿著色呈棕黃色為陽性,計算機圖像分析采用北京航空航天大學圖像分析中心和空軍總醫(yī)院生物醫(yī)學工程研究所研制

12、的CMIAS真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行,在光鏡下(×400)每張切片隨機選取5個視野,用“體視學分析”模型作圖像分析后,計算平均光密度和平均灰度。2.5  統(tǒng)計學方法    數(shù)據(jù)以x±s表示,組間差異性比較采用兩樣本均數(shù)比較的t檢驗。3  結(jié)果(見表1、表2)表1  治療后大鼠再生黏膜厚度、黏膜肌層缺損寬度及黏液厚度(略)注：與模型對照組比較,*P<0.01；與西咪替丁組比較,P<0.05(下同)。表2  黃芪、丹參、黃連對大鼠胃黏膜組織EGFR mRNA表達的影響(略)4  討論&

13、#160;   PU是臨床的常見病、多發(fā)病,目前藥物治療近期愈合較好,但停藥后仍有較高的復(fù)發(fā)率,因此PU的治療應(yīng)著眼于提高遠期療效,防治復(fù)發(fā)。Tarnawski等3首先提出了QOUH的概念,認為潰瘍的愈合不僅需要黏膜缺失的修復(fù),更需要黏膜下組織結(jié)構(gòu)的修復(fù)重建。評價潰瘍愈合的情況不僅僅是內(nèi)鏡或直視下對淺表再生黏膜的觀察,還應(yīng)了解黏膜下組織重建的情況。評價QOUH不僅要評價潰瘍局部再生黏膜結(jié)構(gòu)成熟度,更應(yīng)重視其功能成熟度,并以此判定其對未來潰瘍復(fù)發(fā)的影響及評價藥物對潰瘍的療效。我們在原來研究的基礎(chǔ)上4,試圖從理、法入手,探討健脾化瘀清熱代表藥(黃芪、丹參、黃連)對QOUH的影響

14、,實驗結(jié)果表明：黃芪、丹參、黃連組再生黏膜厚度增加,黏膜肌層缺損寬度減小,與0.9%NaCl溶液組比較,有非常顯著性差異(P<0.01),說明黃芪、丹參、黃連能提高再生黏膜組織學成熟度,提高黏膜修復(fù)能力。黃芪、丹參、黃連組及西咪替丁組表面黏液厚度均高于生理鹽水組(P<0.01),且黃芪、丹參、黃連組又高于西咪替丁組(P<0.01),說明黃芪、丹參、黃連能促進黏液分泌,其作用優(yōu)于西咪替丁。    在眾多生長因子中,與胃腸道上皮生長、修復(fù)有關(guān)的因子很多,但目前研究最多、最受重視的仍是表皮生長因子(EGF)及其EGFR。EGF是一種具有抑制胃酸分泌、促

15、進上皮增殖、組織修復(fù)和細胞保護作用的內(nèi)源性物質(zhì),在保護胃黏膜免受損傷因子破壞、維持胃腸黏膜完整性方面起著非常重要的作用,是近年發(fā)現(xiàn)的在細胞增殖和分化中起重要作用的分子；而生長因子要發(fā)揮作用,必須與相應(yīng)的受體結(jié)合。EGFR是一種單鏈跨細胞膜糖蛋白,對EGF有高度的特異性和親和力,當EGF到達靶細胞表面時,便很快與細胞膜上EGFR結(jié)合,從而發(fā)揮其生理功能,促進組織修復(fù)、潰瘍愈合。實驗結(jié)果表明,黃芪、丹參增強潰瘍周圍組織EGFR mRNA的表達,可能是其提高潰瘍愈合質(zhì)量的機制之一?！緟⒖嘉墨I】  1 楊雪松,李益農(nóng),葉嗣懋,等.大鼠胃潰瘍愈合質(zhì)量與抗強的松再損傷關(guān)系的實驗研究J.北京醫(yī)科大學學報,1996,28(6)：275.2 鄢順琴,鳳良元,陳向濤.胃痛靈保護胃黏膜作用及對胃潰瘍愈合質(zhì)量的影響J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1995,15(10)：6