三氧化二砷抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖的研究

1、    三氧化二砷抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖的研究        摘要：目的：體外試驗研究三氧化二砷對口腔鱗癌的可能治療作用。方法：以人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞為研究對象之一，采用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞，觀察三氧化二砷作用于Tca8113細(xì)胞的量效關(guān)系、時效關(guān)系。采用平皿法姬姆薩染色觀察三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞的克隆形成抑制作用。以舌鱗狀細(xì)胞癌臨床新鮮標(biāo)本組織塊為研究對象之二，消化后細(xì)胞懸液與各濃度三氧化二砷、一定濃度的MTX、5-Fu、PYM體外培養(yǎng)后MTT法測

2、定臨床舌癌細(xì)胞生長抑制率。結(jié)果：三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞、臨床舌癌細(xì)胞均有顯著生長抑制作用。1mol As2O3臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計數(shù)Tca8113細(xì)胞生長抑制率28.57%，克隆形成抑制率31.01%;3mol As2O3濃度Tca8113細(xì)胞生長抑制率58.36%，克隆形成抑制率76.63%;5mol As2O3濃度Tca8113細(xì)胞生長抑制率86.03%,克隆形成抑制率91.30%。體外藥敏測定：1mol濃度As2O3的臨床舌癌細(xì)胞的生長抑制率39.5%，3mol濃度As2O3為47.2%，5mol濃度As2O3為89%，MTX為36.5%，5-Fu為41.3%，PYM為58.16%

3、。臨床藥敏標(biāo)準(zhǔn)一般大于30%為敏感，PYM大于50%為敏感。結(jié)論：體外試驗表明三氧化二砷可顯著抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞的生長，對臨床癌細(xì)胞也表現(xiàn)了良好的抗增殖作用，三氧化二砷可能成為治療口腔鱗癌的有效藥物。關(guān)鍵詞：砷劑；口腔鱗癌；藥物敏感性試驗中分類號：R739.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1005-4979(1999)03-222-03 PRELIMINARY STUDY OF ARSENIC TRIOXIDE IN THE TREATMENTOF ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMAWANG Yue-ping, ZHU Han-guang, ZHANG

4、zhi-yuan et al.The Ninth hospital Shanghai second University. Shanghai 200025;Abstract: Objective： To explore the possible anticancer effect of arsenic trioxide (As2O3) on oral cancer in vitro.Methods： Tongue squamous cell carcinoma cell Tca8113 and cells isolated from clinical tongue squamous cell

5、carcinoma specimen was used in vitro studies. The anticancer effect of As2O3 on oral carcinoma cell cancer was studied by MTT Assay and human tumor colony Assay (HTCA).Results： As2O3 obviously inhibited the growth and survial of Tca8113 and Tongue cancer ell. The tumor inhibition rate (TLR) was 86.3

6、% and the tumor colony forming inhibition rat was 91.3% for the Tca8113 with 3umol As2O3. The drug sensitity of antitumor drugs was 47.2% with 3umol As2O3、36.5% with the MTX、41.3% with the 5-Fu and 58.6% with the PYM for cells isolated from the tongue carcinoma specimen. Conclusion: The As2O3 might

7、be one efficient drugs in the treatment of oral squamous cell carcinoma in vitro study.Key words: Arsenic; Trioxide squamous cell carcinoma; Oral anticancer drug sensitivity三氧化二砷是最早用于治療惡性腫瘤的化療藥物之一，在近一個世紀(jì)的研究中，三氧化二砷既作為毒物致死人命，又被認(rèn)為是惡性腫瘤的誘導(dǎo)劑，特別象是肺癌和皮膚癌的致癌物。近來，三氧化二砷用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了顯著的療效，對其機(jī)理的研究表明三氧化二砷是一種

8、凋亡誘導(dǎo)劑和增殖抑制劑，其對其它惡生腫瘤的作用即抗瘤譜還不清楚。本研究對三氧化二砷在口腔舌鱗癌中的抗增殖作用進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)報導(dǎo)如下：材料和方法1材料1.1舌癌細(xì)胞：采用人舌癌細(xì)胞系Tca8113作為靶細(xì)胞之一，以PRMI1640完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。實驗時將Tca8113細(xì)胞株細(xì)胞消化計數(shù)調(diào)整濃度為2×105/ml。將臨床手術(shù)切除的人舌癌原發(fā)灶標(biāo)本制成一定濃度的細(xì)胞懸液，同樣以PRMI1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。1.2化療藥物：As2O3哈爾濱醫(yī)大附一院制備，儲存液以生理鹽水稀釋為100mol/L。順鉑(DDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤(MTX)、氮芥(HN2)、平陽霉素(

9、BLEO)。2方法2.1將形態(tài)正常、生長良好的Tca8113細(xì)胞消化后，以2×105個細(xì)胞/ml的濃度接種于PRMI1640培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)(37°C，5%CO2)。實驗時收集細(xì)胞并用臺盼藍(lán)拒染法計數(shù)活細(xì)胞。細(xì)胞活力(%)=活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%；生長抑制率(%)=(對照組-實驗組)/對照組活細(xì)胞數(shù)×100%。2.2取對數(shù)增殖期細(xì)胞，0.25%胰酶消化單細(xì)胞懸液，將150200個Tca8113細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，37°C、5% CO2飽和空氣和濕度條件下培養(yǎng)24小時后加入藥物，繼續(xù)培養(yǎng)12天后終止培養(yǎng)，固定后姬姆薩染色，計數(shù)細(xì)胞集落，(細(xì)胞數(shù)

10、50個為一個集落)?？寺⌒纬梢种坡?(1-實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。2.3將臨床切除的新鮮舌癌標(biāo)本組織塊制成一定濃度的癌細(xì)胞懸液，采用MTT法檢測As2O3-10mol/L、CDDP100g/ml、MTX、5-FU、NH2、BLEO的抗增殖作用。3結(jié)果3.1三氧化二砷對Tca8113的抗增殖抑制作用根據(jù)臺盼藍(lán)活細(xì)胞拒染法計數(shù)結(jié)果，得到三氧化二砷作用Tca8113細(xì)胞的不同時間、不同濃度的抗增殖抑制率，作出其量-效、時-效關(guān)系。(如1、2)在5mol/L濃度下作用Tca8113細(xì)胞72小時時，增殖抑制率達(dá)86.03%，作用120小時達(dá)95.15%。1三氧化二砷對Tca81

11、13細(xì)胞抗增殖作用的量效關(guān)系2三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞抗增殖作用的時效關(guān)系3.2三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞的克隆形成抑制試驗結(jié)果克隆形成抑制試驗也表明三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞有明顯的抗增殖抑制作用。在3mol/L濃度下其克隆形成抑制率76.63%，5mol/L濃度下克隆形成抑制率91.30%。(見3)3三氧化二砷對Tca8113細(xì)胞克隆形成抑制率的影響3.3三氧化二砷對臨床舌癌細(xì)胞的藥敏測定7例臨床舌癌患者的臨床標(biāo)本分離細(xì)胞的藥敏測定結(jié)果表明，三氧化二砷有較好的臨床應(yīng)用前景。三氧化二砷5例敏感，其1mol/L濃度下平均抑制率為39.5%;3mol/L濃度為47.2%;5mol/

12、L濃度下89%。PYM 5例敏感，平均抑制率為58.16%。MTX 6例敏感，平均抑制率為36.5%。5-Fu 6例敏感，平均抑制率為41.3%。3.4形態(tài)學(xué)變化倒置顯微鏡下見對照組細(xì)胞伸展性好，界限清楚，胞質(zhì)均勻，核大，核仁清楚，細(xì)胞分裂相多見，生長良好，形成致密貼壁的多角形細(xì)胞。三氧化二砷低濃度組表面為細(xì)胞外形改變不明顯，但細(xì)胞胞漿有發(fā)泡樣表現(xiàn)。高濃度組孤立細(xì)胞多見，分裂相罕見，有較多細(xì)胞浮起。姬姆薩染色后觀察，低濃度組可見細(xì)胞核濃縮、邊聚，高濃度組細(xì)胞核膜不完整，細(xì)胞發(fā)泡更明顯。4討論三氧化二砷是人類最早用于治療惡性腫瘤的化學(xué)藥物之一，公元前16世紀(jì)即有砷劑治療淺表皮膚癌的記錄，19世紀(jì)

13、Lissauer應(yīng)用亞砷酸溶液治療慢性白細(xì)胞，這被認(rèn)為是第一次使用抗癌藥物治療惡性腫瘤，本療法直到20世紀(jì)30年代仍被報導(dǎo)用以治療慢性髓細(xì)胞性白細(xì)胞1。本世紀(jì)50年代由于新的化療藥的不斷發(fā)現(xiàn)，因砷劑的口服毒性極大其在腫瘤治療領(lǐng)域漸被淘汰。三氧化二砷即砒霜，又是一種毒藥。中毒劑量1050mg，致死劑量60mg2?？诜⒘康纳閯﹨s有一定的有利的生物學(xué)效應(yīng)，可擴(kuò)張胃腸道的血管，促進(jìn)微循環(huán)，改善分泌和吸收，也可升高白細(xì)胞；但在較大劑量下，可能引起毛細(xì)血管的極度擴(kuò)張，刺激粘膜形成水泡，引起腹痛、腹瀉、便血等中毒現(xiàn)象3。在砷劑的毒理學(xué)研究中還發(fā)現(xiàn)砷是肺癌和皮膚癌的誘導(dǎo)劑4。現(xiàn)代砷劑在惡性腫瘤治療中的應(yīng)用是

14、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院純化砷劑注射液“癌靈一號”并且用于治療急性早幼粒細(xì)胞白細(xì)胞取得顯效開始5，上海第二醫(yī)科大學(xué)瑞金醫(yī)院上海血液學(xué)研究所對其治療機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)三氧化二砷的治療作用是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且可能快速降解PML/RAR 融合基因蛋白或進(jìn)行性下調(diào)bcl-2基因的mRNA和蛋白表達(dá)途徑而誘導(dǎo)凋亡6。體外研究的報導(dǎo)表明，三氧化二砷對實體瘤食道癌、胃癌、直腸-結(jié)腸癌有相同的研究結(jié)果7，但臨床一直未見有三氧化二砷在治療實體瘤取得顯效的報導(dǎo)。我們的體外研究從舌癌細(xì)胞系Tca8113細(xì)胞和臨床舌癌標(biāo)本分離腫瘤細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)三氧化二砷對其有明顯的抗增殖抑制作用。5mol/L濃度下作用Tca8113細(xì)

15、胞72小時增殖抑制率達(dá)86.03%，作用120小時達(dá)95.15%，其克隆形成抑制率達(dá)91.30%；臨床藥敏測定亦表明三氧化二砷與臨床常用化療藥PYM、MTX、5-Fu的藥敏無明顯差異，三氧化二砷應(yīng)該有可能成為治療口腔惡性腫瘤的有效化療藥物。三氧化二砷進(jìn)入血液后，95%97%與紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白結(jié)合，再分布至全身各組織器官8。倪建華等研究三氧化二砷的藥代動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，持續(xù)二小時滴注100mol/L濃度的三氧化二砷注射液500ml,測得其血濃度峰值僅為4.7mol/L，其擴(kuò)散至實體腫瘤組織中的濃度肯定是較低的，我們的進(jìn)一步研究也證實了這一點。三氧化二砷治療實體瘤能否取得顯效，其進(jìn)入腫瘤組織的途徑有可能是其關(guān)鍵所在。作者簡介：王躍平(1963-)，男，主治醫(yī)師，口腔醫(yī)學(xué)碩士，現(xiàn)在黃浦區(qū)中心醫(yī)院口腔科作者單位：上海第二醫(yī)科大學(xué)第九人民醫(yī)院(200011)參考文獻(xiàn)：1李振主編.惡性腫瘤的化學(xué)治療與免疫治療.人民衛(wèi)生出版社，1.2倪建華，陳國強(qiáng)，沈志祥等.靜脈滴注三氧化二砷治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥代動力學(xué)分析.中華血液學(xué)雜志，1997，18：250.3王振義，陳竺主編.腫瘤的誘導(dǎo)分化和凋亡療法.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，257.4IARC. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to man.