淺論超聲微泡在缺血性疾病治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

1、淺論超聲微泡在缺血性疾病治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展                    作者：施曉宇范國峰童嘉毅【關(guān)鍵詞】  超聲波微泡造影劑溶栓血管新生干細(xì)胞隨著超聲影像新技術(shù)的不斷發(fā)展和超聲造影劑制備技術(shù)的不斷改進(jìn)，超聲微泡在疾病診斷和治療中的作用日趨重要。近年來國外開始了靶向超聲微泡治療疾病的相關(guān)研究，將超聲微泡作為一種載體，利用超聲波與微泡造影劑的相互作用及所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)所攜帶藥物及基因等向靶

2、組織的轉(zhuǎn)移釋放，起到靶向治療的作用?，F(xiàn)僅就超聲介導(dǎo)微泡在缺血性疾病治療中的相關(guān)應(yīng)用研究作一綜述。   1  超聲微泡及其效應(yīng)   1.1  超聲微泡   微泡由核心及外殼兩個(gè)部分組成，核心由二氧化碳、氧氣、空氣或大分子惰性氣體(多為氟烷氣體)等構(gòu)成，外殼(即包膜)可由磷脂類化合物、白蛋白、糖類、非離子表面活性劑或可生物降解的高分子多聚物等不同材料組成。不同類型外殼的微泡造影劑具有不同的特性和應(yīng)用價(jià)值，多數(shù)研究選用含有全氟顯氣體的白蛋白或脂質(zhì)外殼的微泡。新近研究的納米級微泡，如液態(tài)氟碳微泡，直徑小于100 nm，能夠

3、穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，在體內(nèi)循環(huán)半衰期長，可用作超聲、CT、MRI造影劑，連接放射性物質(zhì)還可作為核醫(yī)學(xué)造影劑。   1.2  超聲介導(dǎo)微泡的機(jī)械及生物學(xué)效應(yīng)1.2.1  超聲輻射力 超聲在聲波傳播方向產(chǎn)生原發(fā)性輻射力，使微泡向血管壁移位，流動速度下降；同時(shí)微泡之間產(chǎn)生繼發(fā)性輻射力，使微泡間黏附增加。在超聲輻射力的作用下，微泡在局部血管的黏附力可增加20倍以上1。1.2.2  空化效應(yīng) 空化效應(yīng)指液體中存在的微小氣泡(空化核)在聲波作用下產(chǎn)生的振蕩、擴(kuò)大、收縮至內(nèi)爆等一系列動力學(xué)過程。血液中存在微泡造影劑時(shí)，微泡相當(dāng)于血液中的

4、空化核，當(dāng)聲壓大于100 kPa時(shí)，就會產(chǎn)生空化效應(yīng)。聲強(qiáng)度較小時(shí)，微泡圍繞平衡半徑振蕩，稱為穩(wěn)態(tài)空化。在每一個(gè)振蕩微泡周圍的不均一環(huán)狀區(qū)域?qū)a(chǎn)生直徑較小的穩(wěn)定、均勻的血流束，稱為微束，其速度及切變率與微泡振動幅度成正比。當(dāng)聲強(qiáng)度繼續(xù)增加時(shí)，微泡在超聲作用下劇烈振蕩，先膨脹后迅速萎陷。氣泡內(nèi)爆的瞬間，泡內(nèi)聚集的能量(理論上可達(dá)聲波能量的1011倍)迅即釋放出來，在空化發(fā)生的微小空間內(nèi)形成高溫(5 000 K以上)、高壓（107 Pa以上），稱為瞬間空化。瞬間空化所產(chǎn)生的高溫可以引起光輻射，導(dǎo)致分子內(nèi)部鍵裂解而形成自由基。如果瞬間空化發(fā)生在固體表面附件，微泡呈不對稱塌陷，產(chǎn)生沖擊波和碰射流，可

5、損傷固體表面2。1.2.3  聲孔效應(yīng) 1997年Bao等3首次發(fā)現(xiàn)含微泡的中華田鼠卵巢細(xì)胞懸浮液經(jīng)超聲輻照后，細(xì)胞膜對胞內(nèi)外大分子通透性暫時(shí)開放，隨后閉合，稱此為聲孔效應(yīng)。2000年Ward等4研究淋巴細(xì)胞懸浮液發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻照時(shí)間一定、微泡濃度增高或者微泡濃度不變、超聲輻照劑量增加時(shí)，出現(xiàn)兩種聲孔效應(yīng)，即可修復(fù)性聲孔效應(yīng)和致死性聲孔效應(yīng)。目前認(rèn)為低于瞬間空化閾值時(shí)，聲孔效應(yīng)是微束所產(chǎn)生的剪切力作用；當(dāng)高于瞬間空化閾值時(shí)，聲孔效應(yīng)則由不均一的微泡萎陷時(shí)產(chǎn)生瞬間空化所引起。    2  超聲微泡在缺血性疾病治療中的應(yīng)用2.1 

6、溶栓治療    血栓形成和栓塞是缺血性疾病，如急性心肌梗死、腦卒中的關(guān)鍵因素，及時(shí)、有效的溶栓治療常能挽救患者生命。目前溶栓治療中，靜脈藥物溶栓的藥物劑量大，出血等并發(fā)癥多；經(jīng)介入選擇性動脈藥物溶栓的藥物劑量雖減少，但治療條件要求高，費(fèi)時(shí)多，花費(fèi)昂貴，尚不能充分開展。而國內(nèi)外已有研究證實(shí)，一定條件下，超聲聯(lián)合微泡可以溶解血栓，并且不會引起出血等并發(fā)癥。1995年Thomas等5首次報(bào)道了真正有實(shí)際意義的超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)溶栓的實(shí)驗(yàn)。此后一系列的研究結(jié)果6表明，超聲介導(dǎo)微泡可獲得優(yōu)于單純超聲輻照的溶栓效果，而且在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，以微泡加超聲加溶栓藥聯(lián)合應(yīng)用可獲得更好的溶

7、栓效果。    此外，在微泡表面結(jié)合能識別纖維素或血凝塊成分的配體，將溶栓藥置于微泡膜的內(nèi)層和外層之間，攜帶溶栓藥物到達(dá)靶位點(diǎn)的靶向溶栓治療也正在研制中。Unger等7報(bào)道MRX 408脂質(zhì)微泡可結(jié)合特異性寡肽，與活化血小板的GP b/a受體具有強(qiáng)的親和力，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，微泡可特異性地結(jié)合到血凝塊上，不僅被血栓周邊或表面攝取，而且吸收到血栓塊的深部。近期已成功構(gòu)建含活性氣體NO的超聲微泡，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)超聲破壞微泡釋放NO能夠進(jìn)一步增強(qiáng)溶栓作用8。   目前認(rèn)為，超聲微泡溶栓、助溶作用主要是空化效應(yīng)?？栈?yīng)增寬血栓中纖維蛋白鏈的間距，

8、增強(qiáng)血栓的“多孔性”，使藥物和微泡更易于向血栓內(nèi)滲透。即使在沒有外源性溶栓藥物的情況下，內(nèi)生性纖維蛋白溶酶激活劑向血栓內(nèi)的滲入也會被增強(qiáng)。    2.2  攜帶基因治療   隨著對疾病分子機(jī)制的認(rèn)識和人類基因組研究的進(jìn)展，基因治療成為一種新的有前景的治療方法。但目前基因治療還存在一些問題，如缺乏安全、有效、有組織特異性和靶向性的基因轉(zhuǎn)載系統(tǒng),缺乏穩(wěn)定的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后的宿主反應(yīng)等。目前基因?qū)氲姆绞蕉酁閷⒛康幕蛑苯幼⑸溆诎薪M織，如心血管疾病多采用心肌內(nèi)直接注射方法，或向心導(dǎo)管注入質(zhì)粒DNA或腺病毒載體，但其有創(chuàng)性和轉(zhuǎn)染效率低等缺點(diǎn)限制了

9、其臨床應(yīng)用。   超聲微泡造影劑為基因治療提供了一種安全、高效的新型載體，研究涉及心臟、血管、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、腫瘤等眾多領(lǐng)域，特別是缺血性疾病如心肌梗死、外周動脈疾病的基因治療。豬冠狀動脈再狹窄模型中，應(yīng)用微泡靶向遞送反義硫代磷酸化寡核苷酸轉(zhuǎn)染冠狀動脈，可以抑制血管內(nèi)膜增生9；同樣，應(yīng)用Optison微泡靶向轉(zhuǎn)染E2F基因可以明顯抑制球囊損傷后的兔頸動脈血管內(nèi)膜增生10。與局部骨骼肌單獨(dú)注射編碼綠色熒光蛋白(GFP)的裸質(zhì)粒相比，注射攜帶GFP質(zhì)粒的Optison，超聲能明顯增加GFP表達(dá)量，同時(shí)減輕肌肉損傷11。此外，Tiukinhow等12證實(shí)，靜脈注射攜帶肝細(xì)胞

10、生長因子的Optison，超聲作用后可以增加兔骨骼肌毛細(xì)血管密度，改善局部供血。   超聲破壞微泡增強(qiáng)DNA靶向遞送的可能機(jī)制：（1）DNA通過微泡在靶向區(qū)域裂解被釋放，提高目標(biāo)部位濃度；（2）穩(wěn)定空化微泡周圍可產(chǎn)生環(huán)狀渦流和強(qiáng)大的切變率，加速DNA擴(kuò)散；（3）超聲微泡作用下血管壁通透性增加，細(xì)胞膜滲透性提高。   2.3  促進(jìn)血管新生   動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展或破裂引起受累器官供血減少是缺血性疾病的主要病因。通過遞送細(xì)胞因子、生長因子基因或蛋白至缺血組織，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)其增殖、遷徙以及治療性血管生成，已證實(shí)能夠

11、增加局部血流灌注，改善器官功能。Song等13于2002年首次通過實(shí)驗(yàn)證明,超聲破壞微泡使大鼠后肢骨骼肌小動脈密度較對照組增加約65%，同時(shí)小動脈直徑也增加，局部血流量增加約57。其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)14表明，超聲聯(lián)合微泡能夠靶向促進(jìn)大鼠缺血后肢小動脈生成，改善缺血區(qū)營養(yǎng)血流量。   超聲介導(dǎo)微泡促進(jìn)血管新生的機(jī)制為：（1）超聲破壞微泡的空化效應(yīng)引起直徑7 m的微血管破裂，而對大血管無影響，是對機(jī)體的無菌性炎癥刺激，誘導(dǎo)局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞）在局部浸潤并釋放血管生長因子(主要是VEGF),從而促進(jìn)小血管新生15；（2）通過CD18依賴機(jī)制募集骨髓來源的

12、單個(gè)核干細(xì)胞參與血管新生，但不直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞16。   超聲介導(dǎo)微泡可刺激血管形成，但新生血管是滲透、迂曲的，血管管徑不一致，是否能維持微循環(huán)還有待進(jìn)一步研究；此外目前的實(shí)驗(yàn)研究大多在大鼠骨骼肌模型上進(jìn)行，在大動物乃至人體以及心肌組織是否有同樣的效應(yīng)仍不清楚。   2.4 增效干細(xì)胞治療   隨著細(xì)胞生物工程技術(shù)的發(fā)展和對干細(xì)胞研究的不斷深入，采用生物學(xué)技術(shù)，將不同組織來源的干細(xì)胞通過不同的途徑進(jìn)行干細(xì)胞移植治療，以期替代、修復(fù)或改善受損缺血組織的生物學(xué)功能，顯示出良好的臨床應(yīng)用前景。目前研究較多的是干細(xì)胞移植治療心肌梗死，但

13、還存在移植細(xì)胞數(shù)量、途徑、安全性及作用機(jī)制等急需解決的基本問題。動物及臨床研究提示，干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病能夠改善心肌功能，但效果仍不肯定，甚至相互矛盾。             國內(nèi)外動物實(shí)驗(yàn)1720均表明，超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)移植干細(xì)胞缺血區(qū)歸巢數(shù)量，增強(qiáng)血管新生和小動脈生成，改善缺血骨骼肌和心肌局部血流量，恢復(fù)心肌收縮功能和骨骼肌運(yùn)動功能，并且對移植干細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期無不良影響21。超聲介導(dǎo)微泡增效干細(xì)胞治療的機(jī)制目前仍不明確，推測和下列因素有關(guān)：（1）空化效應(yīng)引起局部炎

14、癥反應(yīng)，局部聚集巨噬/單核細(xì)胞、血小板分泌炎癥因子（如TNF、IL1），促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子（如P選擇素、ICAM1、VCAM1），增加移植干細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞1314；（2)體外研究表明，超聲介導(dǎo)微泡作用下，鄰近內(nèi)皮細(xì)胞對胞外大分子物質(zhì)通透性增加，該作用可持續(xù)3 min左右，而且血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬19，可能使移植干細(xì)胞在缺血局部遷移增多；（3）超聲微泡能夠增加局部組織生長因子（如VEGF、bFGF）mRNA表達(dá)和生成，促進(jìn)移植干細(xì)胞增殖和分化，同時(shí)發(fā)揮旁分泌治療作用18。    3 目前存在問題   近十幾年來，超聲微泡的研究取得了明顯進(jìn)

15、展,使用領(lǐng)域越來越多，但隨著對超聲波及微泡認(rèn)識的深入，人們也逐漸認(rèn)識到對它們的廣泛應(yīng)用目前還存在一些問題有待解決。超聲介導(dǎo)微泡發(fā)生過多瞬間空化，可引起毛細(xì)血管破裂、紅細(xì)胞外滲、內(nèi)皮細(xì)胞破壞、血管內(nèi)溶血、體外培養(yǎng)細(xì)胞和含氣組織及器官(如肺和腸)損傷。超聲破壞微泡作用于離體大鼠心臟，可引起心室收縮功能可逆、短暫性的降低，冠狀動脈灌注壓的增高和心肌組織內(nèi)乳酸鹽的過量沉積，與超聲機(jī)械指數(shù)呈正相關(guān)22。這一系列的副作用可能直接歸因于超聲破壞微泡所引起的機(jī)械作用，因此，有必要對超聲介導(dǎo)微泡治療相關(guān)疾病的超聲參數(shù)進(jìn)行更深入的優(yōu)化，同時(shí)改進(jìn)超聲微泡的制作工藝，從而充分發(fā)揮有益的生物學(xué)效應(yīng)，減少可能的組織損傷。

16、   綜上所述，隨著分子生物學(xué)、物理化學(xué)及材料學(xué)(包括納米技術(shù))等新技術(shù)在超聲及造影劑微泡中的應(yīng)用，超聲微泡造影劑在疾病診斷和治療領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。隨著生物工程研究的發(fā)展和對疾病認(rèn)識的深入，超聲聯(lián)合微泡治療缺血性疾病將會得到越來越廣泛的應(yīng)用，有望成為一種有效、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)、安全的新治療手段。【參考文獻(xiàn)】  1AARON F H L,MARK A B,PAUL A D,et al.Ultrasound radiation force enables targeted deposition of model drug carriers loaded on micr

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