烏梅等提取物的抑菌作用研究【開(kāi)題報(bào)告】

1、開(kāi)題報(bào)告藥學(xué)烏梅等提取物的抑菌作用研究一、綜述本課題國(guó)內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)，說(shuō)明選題的依據(jù)和意義烏梅(FuCtuS Mume)是由薔薇科植物梅Pru nus mume (Sieb. ) Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)加工而成。始載于神農(nóng)本草經(jīng)，列為中品。烏梅性平，味酸澀， 歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，具有斂肺澀腸、生津止渴、驅(qū)蟲(chóng)止痢的功效。它含有豐富的有 機(jī)酸。如檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、乳酸、琥珀酸、焦精谷氨酸、甲酸、丙酸、乙酸、延 胡索酸等，其中以檸檬酸和蘋(píng)果酸含量最高。 此外，烏梅還含黃酮、 萜類、甾醇、 脂類、 揮發(fā)油、生物堿、糖類等化學(xué)成分。烏梅是一味開(kāi)發(fā)前景廣泛的中藥品種，有相當(dāng)大的挖

2、掘探討的潛力。目前國(guó)內(nèi)外許 多科研人士已從藥理作用角度研究，總結(jié)出其以下幾點(diǎn)作用：( 1)驅(qū)蟲(chóng)作用 實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，烏梅可使蛔蟲(chóng)活動(dòng)增強(qiáng)且可使大部分蛔蟲(chóng)從引流膽 囊中后退。這與烏梅具有收縮膽囊作用，并可增加膽汁分泌、使膽汁趨于酸性和松弛膽 道口括約肌的作用有關(guān)。( 2)對(duì)平滑肌的作用 烏梅煎液能增強(qiáng)豚鼠離體膀胱逼尿肌肌條的張力，增加膀 胱逼尿肌肌條的收縮頻率和收縮波平均振幅，其作用機(jī)理可能與興奮細(xì)胞膜膜上 L 型 CaT通道作用有關(guān)。烏梅對(duì)豚鼠離體膽囊的作用表現(xiàn)為雙向性反應(yīng)，即低濃度烏梅對(duì)膽 囊肌條表現(xiàn)為抑制作用，當(dāng)烏梅累積至一定濃度時(shí)，對(duì)膽囊肌條的張力呈現(xiàn)為先降低后 增高的雙向性反應(yīng)。(3) 抗

3、腫瘤作用 烏梅煎劑對(duì)小鼠肉瘤S80艾氏膠水瘤有抑制作用，體外試驗(yàn)對(duì)人 子宮頸瘤 JTC-2s 株的抑制率在 90 以上。體外抗腫瘤及體外免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果表明， 烏梅水提液、醇提液具有抑制人原始巨核白血病細(xì)胞和人早幼粒白血病細(xì)胞生長(zhǎng)的作 用，對(duì)這兩種細(xì)胞的克隆形成都有不同程度的抑制作用，呈一定的量效關(guān)系。烏梅對(duì) HL-40細(xì)胞的作用機(jī)制之一是抑制了細(xì)胞 DNA合成，并使細(xì)胞停滯于 G2M期。低濃度 烏梅水提液和醇提液對(duì)小鼠免疫器官和體液免疫無(wú)明顯影響，而高濃度( 10g kg-1)烏 梅水提液則能明顯減輕小鼠胸腺、脾臟、肝臟的重量，但對(duì)體液免疫影響不明顯。提示 烏梅抗腫瘤作用通過(guò)整體免疫調(diào)節(jié)而達(dá)

4、到的可能性較小，可能以對(duì)腫瘤的直接作用為 主。烏梅的抗腫瘤作用與其 pH 值無(wú)關(guān)，所含熊果酸具有一定作用，但非主要成分。（4）抗生育作用 烏梅煎液對(duì)末孕和早孕大鼠子宮平滑肌均有興奮作用，妊娠子 宮對(duì)其尤為敏感，有明顯的抗著床、抗早孕作用。烏梅有較強(qiáng)的殺精子作用，其主要有 效成分為烏梅 - 枸櫞酸，其殺精子機(jī)理為破壞精子的頂體、線粒體及膜結(jié)構(gòu)，最低有效 濃度為 0.09 。同時(shí)烏梅 - 枸櫞酸具有良好的阻抑精子穿透宮頸粘液的作用，精子經(jīng)不 同濃度烏梅 - 枸櫞酸作用后，運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱，精子穿透宮頸粘液管的距離與精子受 烏梅-枸櫞酸作用的濃度呈負(fù)相關(guān)。（5）抗過(guò)敏作用 烏梅對(duì)豚鼠的蛋白質(zhì)過(guò)敏性及

5、組織胺休克具有對(duì)抗作用，但對(duì)組 織胺性哮喘則無(wú)對(duì)抗作用。（6）抗氧化作用 烏梅對(duì)鄰苯三酚及腎上腺素氧化系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基有很強(qiáng)的 清除能力，并在垂直凝膠電泳中表現(xiàn)出抑制氮藍(lán)四唑 （NBT）光化還原的能力。體外試驗(yàn) 表明，烏梅果槳有明顯抗氧化溶血和抗肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化作用，且抑制率和劑量呈正相 關(guān)。（7）解毒作用 烏梅所含琥珀酸是重金屬及巴比妥類藥物中毒的解毒劑，枸櫞酸 可做堿中毒的解毒劑。（8）其他作用 烏梅提取物體外具有抑凝血抗纖溶活性、抗衰老和保肝等作用。 綜上所述，可以看出，目前對(duì)烏梅的研究還不夠深入，尤其是從烏梅的化學(xué)成分從藥用的角度研究并不多，烏梅藥理作用機(jī)制研究得較少，烏梅現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)

6、準(zhǔn)仍有較大的 局限性等。應(yīng)結(jié)合藥理分離提取烏梅的有效成分，闡明其藥理作用機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)新的具 有較強(qiáng)活性的化合物創(chuàng)造條件。本文是對(duì)烏梅中提取液抑菌的研究。在體其外對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、 副傷寒桿菌、霍亂桿菌、百日咳桿菌、變形桿菌、炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、類白喉?xiàng)U菌、 人型結(jié)核桿菌、腦膜炎球菌、金葡菌、肺炎球菌、溶血性鏈球菌等均有抑制作用，其醇 浸漬液對(duì)沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌作用敏感，其 MBC 0.015g mL-1。烏梅水煎液對(duì)臨床分 離得到的28株腸球菌有很好的抑制作用，其MIC90為1:320。研究發(fā)現(xiàn)烏梅對(duì)腦膜炎球 菌有較強(qiáng)的體外抑菌作用。烏梅的抑菌作用強(qiáng)弱受采收、加工、植物基原的影響

7、，以核 仁、果肉均成熟時(shí)采收加工的烏梅比其它時(shí)期采收加工的烏梅抑菌作用強(qiáng)；燙曬法與烘 干法的加工成的烏梅抑菌效應(yīng)相同， 熏法制成的烏梅對(duì)某些菌的作用略優(yōu)于燙曬、 烘法， 松木或雜木熏制的烏梅，對(duì)痢疾、傷寒桿菌的敏感度稍有不同，但差異不明顯；比較了不同基原的烏梅，對(duì)腸道致病菌均有一定的作用，但對(duì)某一細(xì)菌的作用程度稍有差異。二、研究的基本內(nèi)容，擬解決的主要問(wèn)題：基本內(nèi)容：本實(shí)驗(yàn)對(duì)烏梅、仙人掌、芙蓉菊用乙醇等不同溶劑浸提，并對(duì)臨床常 見(jiàn)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶菌等病原菌進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，確定最佳抑菌提 取物。以抑菌圈直徑為參考，進(jìn)一步考察在不同PH、溫度、時(shí)間、光照等提取條件下提取物抗菌效果

8、。旨在探索頗具開(kāi)發(fā)潛力抗感染的中草藥。擬解決問(wèn)題： 1、烏梅、仙人掌、芙蓉菊用不同溶劑的提取。2、抑菌圈直徑的測(cè)定。3、平板的制備及打孔。4、病原菌的接種及培養(yǎng)。三、研究步驟、方法及措施：1粗提物的制備醇提法：稱取烏梅粉末50g,用95%勺乙醇溶液回流提取2次，每次3 h,倒出兩次的 溶液合并后，過(guò)濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，將濾液減壓蒸餾至10g,即得烏梅莖 中的抑菌物得到濃縮記為 1 號(hào)。酸提法：1、稱取烏梅粉末50g,用石油醚（30-60 C）回流提取2次，每次3 h,倒 出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 2 號(hào)。 2、在圓 底燒瓶中加入乙醚溶液回流提取

9、 2次，每次3 h,倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 3 號(hào)。 3、在圓底燒瓶中加入乙醇水溶液回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為 4號(hào)。 4、在圓底燒瓶中加入沸水回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的濃縮液記為5號(hào)。5、在圓底燒瓶中加入1%HCl溶液回流提取 2 次，每次 3 h, 倒出兩次的溶液合并后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮，得到的 濃縮液記為 6 號(hào)。水提法：稱取稱取烏梅粉末 50g, 用蒸餾水凈泡 48 h, 過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)

10、濃縮，將濾液減壓蒸餾至10g,即得烏梅粉末的抑菌物，記為7號(hào)。2 抑菌性的測(cè)定3 培養(yǎng)基的制備量取 200ml 蒸餾水于 400ml 的燒杯中放在萬(wàn)用電爐上加熱至沸騰，然后按 3.5 ：100 的固液比加入7g營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基使其溶解制成溶液，然后用三角瓶分裝，于121C的電熱殺 菌鍋中滅菌 20 分鐘，待用。4 試驗(yàn)菌種的活化將斜面培養(yǎng)基上的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌接種到 250mL三角瓶 的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)箱中以120rmin的轉(zhuǎn)速和37C的溫度下活化培養(yǎng)24h 后，移出ImL菌液在相同條件下重復(fù)培養(yǎng)相同時(shí)間，得到初始菌液。5 菌懸液的制備用無(wú)菌生理鹽水將大腸桿菌、金黃

11、色葡萄球菌、副溶血性弧菌稀釋成濃度都在1×1025× 102CfumL。6 平板的制備刮取每種烏梅提取物于試管中，在每支試管中加入 5毫無(wú)水乙醇，用超聲使其溶解 完全。用移液槍移取每種提取物 Iml于其他試管中（該濃度記為100%，再各移取Iml 以該溶液為標(biāo)準(zhǔn)依次稀釋成 75%和 50%濃度的提取液，待用。7 抑菌圈的測(cè)定將 7種提取物分別溶于無(wú)水乙醇中配制成 1的濃度，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，各 種提取物即用及配。將直徑為 6m的無(wú)菌濾紙片浸入濃度為I %的藥物中備用。取經(jīng)活 化的斜面菌種加入生理鹽水中，制成抱子濃度在105-106個(gè)/ml之間的均一菌懸液，再 取0.1m

12、l菌懸液，加入到裝有無(wú)菌的凝固的 PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂抹均勻，貼上上 述準(zhǔn)備好的濾紙片，每皿3片。37C下培養(yǎng)2天，測(cè)定抑菌圈大小。吸取提取物原液0.25 mL至牛津杯中，注意不要將菌懸液溢出牛津杯外。并用無(wú)菌 生理鹽水做空白對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)平行樣，37 C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測(cè)量抑菌圈的大小，結(jié)果取平均值。8最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定用倍比稀釋法將一種藥物水溶液稀釋成 4種濃度，在各平皿內(nèi)分別加2mL不同濃度 的稀釋液，每個(gè)濃度重復(fù)三個(gè)平皿，然后倒入20mL左右已經(jīng)高溫滅菌的固體培養(yǎng)基， 充分混勻，冷卻凝固后，每皿加入 0.2mL 菌懸液涂均，培養(yǎng)(培養(yǎng)方法同上) 。取出觀 察

13、結(jié)果，以不長(zhǎng)菌的稀釋液濃度為最小抑菌濃度( MIC)。將原液稀釋成濃度為 0.6g/ml 、0.3g/ml 、0.15g/m 、0.0625g/ml 、0.0313g/ml 、0.0157g/ml 的濃度梯度，吸取各濃度0.25 mL至牛津杯中，并用無(wú)菌生理鹽水做空白對(duì)照，每個(gè)樣 品設(shè)三個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值，37C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。四、 參考文獻(xiàn)1 陳林，陳鴻平，劉友平等。烏梅不同部位藥理作用研究J。中國(guó)藥房，2007, 18(27): 2089-2090。2 周邦靖編著。用中藥的抗菌作用及其測(cè)定方法 M 。重慶:科學(xué)技術(shù)出版社重慶分 社,1987.7.3 徐叔云，卞如濂，陳修。藥理實(shí)臉?lè)椒▽W(xué) M 北京:人民衛(wèi)生出版社， 2002: 1363-1342。4 童國(guó)忠，石亞素，馬劍茵等。中草藥對(duì)海水養(yǎng)殖黃魚(yú)病原弧菌抑菌效果研究J。水產(chǎn)科學(xué)， 2007， 26 (8): 436-439。5 李仲興，王秀華，趙建宏等 烏梅對(duì) 308 株臨床菌株的抑菌效果 J。 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志， 2007， 14(11): 41-42。6 張顯忠，郭愛(ài)軍，李艷玲等。中草藥提取物的體外抑菌活性研究J。中華