去白細胞血對犬體外循環(huán)心肌缺血再灌注損傷中炎性因子的影響

1、去白細胞血對犬體外循環(huán)心肌缺血再灌注損傷中炎性因子的影響方華1，王泉云1，李昌熙1，劉興奎2，喻田2，余志豪2（1.四川大學華西醫(yī)院，四川 成都 610041；2.遵義醫(yī)學院麻醉學系，貴州 遵義 563003）【摘要】 目的 探討去白細胞血再灌注對犬體外循環(huán)（CPB ）中促炎性細胞因子引起的缺血心肌再灌注損傷的保護效果。方法 成年雜種犬18條，根據(jù)再灌注液成分不同隨機分為對照組（C 組）、全血組（W 組）和去白細胞血組（L 組），每組6條。各組動物經(jīng)麻醉和開胸后，建立體外循環(huán)心肌缺血再灌注實驗模型。C 組在心肌缺血40min 后，于主動脈根部以2ml ·kg -1·min

2、-1灌入晶體再灌注液，持續(xù)20min 。W 組的再灌注液為新鮮動脈全血， L 組在再灌注通路中加用一次性白細胞濾過器（LDF ），再灌注液為去白細胞新鮮動脈血，余均同C 組。L 組分別測定濾過前后血液成分的變化。分別于CPB 前、轉(zhuǎn)機5min 、阻斷60min 、開放30min 和60min 取冠狀竇靜脈血，檢測血清IL-1和IL-8濃度。并于阻斷前、阻斷60min 和開放60min 分別取心肌標本進行髓過氧化物酶（MPO ）活性和丙二醛（MDA ）檢測，于阻斷前、開放30min及開放60min測定血液動力學指標。結(jié)果 濾后白細胞計數(shù)顯著低于濾前；阻斷60min 后各組IL-1和IL-8濃度均

3、升高。阻斷60min 和開放主動脈后，L 組白細胞數(shù)、IL-1和IL-8濃度顯著低于C 組與W 組。與C 組和W 組比較，L 組阻斷60min 和開放主動脈60min 時心肌組織勻漿MPO 活性和MDA 均顯著降低。結(jié)論 CPB 中應用去白細胞血再灌注液可有效地抑制促炎性細胞因子的釋放和活化白細胞介導的心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生較好的心肌保護作用。【關(guān)鍵詞】 去白細胞血 細胞因子 心肌保護 體外循環(huán) 缺血/再灌注損傷Effects of leukocyte-depleted blood on pro-inflammatory mediators during canine myocardial

4、ischemia/reperfusion in cardiopulmonary bypass. Fang hua,Wang Quanyun,Li chang xi, et al.West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041【Abstract 】 Objective To elucidate the protective effect of leukocyte-depleted blood on the pro-inflammatory cytokines-mediated myocardial ischemia-reperfusio

5、n injury during cardiopulmonary bypass (CPB. Methods Eighteen adult healthy hybrid dogs of either sex weighting 12-18kg undergoing CPB, were randomized into 3 groups: the control group (group C,n=6 ,whole blood (group W,n=6 and the experimental group(group L ,n=6 with it use of the leukocyte depleti

6、on filter(LDFon the bypass circuit. All the dogs were anesthesitized with 2.5% sodium pentobarbitone 25mg·kg-1. After tracheal intubation, continuous artery blood pressure and centre venous pressure(CVP were monitored from femoral artery and femoral vein during CPB. In group L,the hearts ,which

7、 were declamping(DC after 60min aortic cross-clamping (AC, were continuously reperfused for 20min with leukocyte-depleted artery blood 2ml·kg-1 by LDF connected with bypass circuit. Control group and group W were treated as group L but employing respectively physiological saline and artery bloo

8、d as a substitute for leukocyte-depleted blood. The blood cells account before and after the filtration were measured. The levels of coronary sinus venous blood serum IL-1 and IL-8 were detected at before CPB、5min following CPB、60min after AC and 30min、60min after DC respectively. Cardiac tissues sa

9、mples were taken for determination of the myeloperoxidase（MPO ）activity and the levels of malondialdehyde（MDA ） before CPB 、60min after AC and 60min after DC. Hemodynamic parameters were measured before CPB、60min after AC and 60min after DC. Results The white blood cell account decreased significant

10、ly after the filtration(P<0.01.Pro-inflammatory cytokines（IL-1and IL-8）concentrations increased significantly after DC in two groups but were notablely lower in group L than those in group C and W(P<0.01.MPO activity and MDA levels at 60min after AC and 60min after DC were distinctly lower in

11、group L than those in group C and W (P<0.01. Conclusions Pro-inflammatory cytokine（IL-1 and IL-8）and neutrophil might participate in inflammation-mediated myocardial ischemia-reperfusion injury which could be distinctly attenuated by infusion of leukocyte-depleted blood to the hear before DC. 【Ke

12、y words】 leukocyte-depleted blood; cytokine; myocardial protection; cardiopulmonary bypass; ischemia-reperfusion injury體外循環(huán)(CPB中，白細胞活化是引起全身性炎癥反應綜合征（SIRS）和心肌缺血再灌注損傷的主要因素之一1?；罨准毎粌H能夠釋放一些促炎性細胞因子（IL-1），還可以通過刺激缺血心肌釋放趨化因子（IL-8）共同參與心肌缺血再灌注損傷，提示IL-1、IL-8與白細胞的協(xié)同作用在心肌缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用。研究證實，祛除或減少再灌注血液中的活化白細胞能

13、夠有效地減輕心肌缺血再灌注損傷2，3，4，而白細胞、IL-1和IL-8共同參與心肌缺血再灌注損傷機制的研究較少，因此，本實驗在犬體外循環(huán)中，于開放升主動脈前應用一次性白細胞濾過器（leukocyte depletion filter，LDF），通過濾除再灌注血液中的活化白細胞，觀察白細胞、IL-1和IL-8在心肌缺血再灌注損傷過程中的相互關(guān)系。1 材料與方法1.1 主要試劑：犬IL-1、IL-8定量ELISA 試劑盒（法國DIACLONE 公司）；髓過氧化物酶（MPO）活性、丙二醛(MDA 試劑盒（均為中國南京建成生物工程研究所）。1.2 實驗動物分組及心臟缺血再灌注動物模型的建立：成年健康雜

14、種犬18只(本院實驗動物中心供，手術(shù)當日晨禁食，雌雄兼用，體重12-18kg，根據(jù)再灌注液的組成隨機(單因素設(shè)計分為三組, 對照組（C組）、全血組（W組）和去白細胞血組（L組），每組6條。C組：麻醉后行氣管內(nèi)插管,連接呼吸機行機械通氣(潮氣量12ml ·kg -1,呼吸頻率16次·min -1。右股動靜脈置管進行平均動脈壓（MAP）、中心靜脈壓（CVP）監(jiān)測，并建立靜脈通路，輸注生理鹽水8ml ·kg -1·h -1。右頸內(nèi)靜脈插入5F 四腔Swan-Ganz 漂浮導管到肺動脈總干,連接西門子sirecter-960型心臟電腦多功能監(jiān)護儀熱稀釋法測定心輸

15、出量。胸骨正中切口 ,切開心包，右心房內(nèi)注射肝素3mg ·kg -1, 全身肝素化后左鎖骨下動脈和右心房分別插管建立體外循環(huán)，升主動脈根部安置PERFEOT 心臟停跳液灌注器(北京普惠生物醫(yī)學工程公司，用復方氯化鈉溶液及706代血漿各500ml 預充Sarns5000型人工心肺機（美國3M 公司）及科威97型鼓泡式氧合器，轉(zhuǎn)機流量為60-80ml ·kg -1·min -1，血液溫度維持在2830，穩(wěn)定轉(zhuǎn)機5min 后阻斷升主動脈，于主動脈根部經(jīng)PERFEOT 灌入4標準 St.Thomas停搏液（K+20mmol ·L -1），灌注量均為10ml &#

16、183;kg -1。C組在心肌缺血40min 后，于主動脈根部以2ml ·kg -1·min -1灌入晶體再灌注液，持續(xù)20min，阻斷升主動脈60min 時，全身復溫至35開放升主動脈，開放升主動脈后觀察循環(huán)情況60min。W 組再灌注液為犬新鮮動脈全血，而L 組在再灌注通路中加用一次性LDF（南京生物醫(yī)學工程研究所），再灌注液為去白細胞新鮮動脈血，連接方法為從微栓過濾器出口與LDF 入口，LDF出口進入出血槽再由血泵入主動脈根部。余均同C 組。1.3 觀察指標：各組采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法定量測定CPB 前、轉(zhuǎn)機5min、阻斷60min、開放30min 和60min

17、 時冠狀竇靜脈血IL-1和IL-8濃度，同期檢測紅細胞壓積(Hct ,按Taylor 公式予以校正。于阻斷前、阻斷60min 和開放60min 分別取心肌標本用硫代巴比妥法測定MDA 含量,比色法測定髓過氧化物酶（MPO）活性。分別于阻斷前、開放30min 及開放60min 時，采用SC7000心臟多功能監(jiān)護儀(美國惠普公司測定心率、CVP 及MAP，并使用Swan-Ganz 漂浮導管熱稀釋法測定心輸出量(CO，并輸入犬體重及心率, 得出心臟指數(shù)(CI 和每搏量(SV，以評價心臟功能。L組應用LDF 前后檢測去白細胞血和全血血液成分。1.4 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間相同時

18、間段比較采用兩標本均數(shù)比較t 檢驗判定差異顯著性，組內(nèi)不同時間段采用團體t 檢驗判定差異顯著性，P<0.05為顯著性差異, P<0.01為非常顯著差異。統(tǒng)計軟件為SPSS11.0。2 結(jié) 果2.1 血液成分的變化：去白細胞血與全血的白細胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），而血小板數(shù)和血紅蛋白含量比較無統(tǒng)計學意義（P0.05）。見表1。表1 兩種血液的變化（±s，n=6）注：與全血組比較，*P0.05，*P0.012.2 IL-1和IL-8濃度變化：對照組和全血組升高趨勢一致,均在開放60min 時達最大值，兩組從阻斷60min 時IL-1和IL-8濃度明顯增加，以后

19、各時段兩組IL-1和IL-8濃度與本組CPB 前比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；全血組IL-1和IL-8濃度與同期對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05。去白組IL-1濃度在阻斷60min 時與本組CPB 前比較有增高,以后各時段有下降趨勢，開放30min 和60min 分別與阻斷60min 比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）；去白組IL-1和IL-8濃度在開放30min 和60min 時與本組CPB 前比較均有增高，但分別與同項 目 全 血 去白細胞血 白細胞（x109/L） 4.28±0.25 0.36±0.29*血小板（x109/L） 126.75±3.

20、36 124.63±5.57 血紅蛋白（g/L） 128.13±4.55 125.52±6.27 紅細胞比容 0.37±0.10 0.33±0.10 pH 7.46±0.05 7.32±0.03 PaO212.38±2.7511.32±1.39期全血組和對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）。去白組IL-8濃度阻斷60min 與本組CPB 前 比較有增高, 但在開放60min 期間濃度基本穩(wěn)定,開放30min 和60min 與阻斷60min 比較差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）。見表2。 2.3 MPO

21、活性和MDA 含量變化：阻斷前,三組MPO 和MDA 差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。阻斷60min 時和開放60min 時與阻斷前比較,對照組及全血組的MPO 和MDA 均明顯升高（P<0.01）。去白組MPO 活性和MDA 含量在阻斷60min 時與本組阻斷前比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；去白組MPO 活性和MDA 含量在阻斷60min 時顯著低于同期全血組和對照組（P0.01）。開放60min 時去白組MPO 活性高于本組阻斷前（P<0.01）和阻斷60min（P<0.05），但與同期全血組和對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P0.01）。去白組在開

22、放60min 時MDA 含量與本組阻斷60min 比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在開放60min 時去白組MDA 含量高于本組阻斷前（P<0.05），但顯著低于同期全血組和對照組（P0.01）。見表3。 表2 三組犬血清IL-1、IL-8濃度的變化（pg/ml，±s，n=6）注：與本組阻斷前比較，P0.05，*P0.01;與本組阻斷60min 比較，P0.05， #P0.01; 與同期全血組比較，P0.05 ，P0.01;與同期對照組比較，P0.05， P0.01表3 心肌MPO（AU/g）活性及MDA（mol/g）含量變化（±s，n=6）注：與本組阻斷

23、前比較，P0.05， *P0.01; 與本組阻斷60min 比較，P0.05， #P0.01; 與同期全血組比較，P0.05， P0.01;與同期對照組比較，P0.05， P0.012.4 血液動力學的變化：開放后各組心臟均電擊除顫,對照組心輸出量在開放30min 和60min 時分別恢復到阻斷前的64%與73%。去白組心輸出量在開放30min 時恢復到阻斷前的47%，但至開放60min 時恢復到阻斷前的70%，與同期對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。全血組復跳時心臟心肌收縮力極弱,全血組心輸出量在開放30min 和60min 時僅恢復到阻斷前的8%和28%。見表4 。3 討

24、論研究表明,白細胞浸潤缺血心肌是心肌再灌注損傷的重要特征,白細胞引起的心臟損傷主要發(fā)生在主動脈開放后再灌注過程中4。體外循環(huán)（CPB）引起白細胞活化是心肌缺血再灌注損傷過程的“啟動因子”之一,白細胞通過釋放多種炎性介質(zhì)激活炎性反應信號傳導引起缺血心肌組織促炎性細胞因子基因表達上調(diào)5，6。MPO 是白細胞產(chǎn)生的特異性蛋白酶,MDA是白細胞活化過程中脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物4,提示MPO 活力與MDA 含量不僅能夠反映心肌組織內(nèi)活化白細胞浸潤的數(shù)目，還可以間接反映白細胞脫顆粒效應以及活化程度。本實驗中,心肌缺血60min 時MPO 活力與MDA 含量明顯升高,主動脈開放后,MPO活力與MDA 含量升高

25、更為顯著，說明CPB 中組 別 CPB 前 轉(zhuǎn)機5min阻斷60min開放30min開放60minIL-1對照組 55.95±13.82 53.74±11.10 157.30±31.59* 196.73±26.43* 211.59±49.79* 全血組 58.61±12.47 62.17±15.29 164.52±27.48* 210.32±21.26* 209.63±23.03* 去白組 58.07±13.5959.63±12.91107.19±17.86*68.

26、38±13.61*60.38±13.49*IL-8對照組 65.27±18.73 64.24±17.35 181.12±19.18*222.82±19.19* 279.17±18.18* 全血組 61.30±15.36 70.35±14.63 227.40±22.71* 271.25±18.55* 283.09±15.89* 去白組66.37±16.2168.24±17.35134.55±8.57*134.63±14.79*128.46

27、±12.95*MPO MDA 組 別阻斷前 阻斷60min 開放60min阻斷前 阻斷60min 開放60min 對照組 0.41±0.16 2.30±0.97* 5.13±1.34* # 0.31±0.01 1.17±0.02* 2.03±0.02* # 全血組 0.36±0.49 3.71±0.68*5.81±0.92* # 0.27±0.13 1.30±0.15* 1.85±0.09* 去白組0.47±0.280.63±0.181.24&#

28、177;0.25*0.33±0.020.45±0.080.81±0.05表4 三組犬血液動力學指標的變化（±s，n=6）注：與本組阻斷前比較，P0.05， *P0.01;與同期全血組比較，P0.05， P0.01;與同期對照組比較，P0.05， P0.01大量白細胞活化,開放升主動脈后雖然恢復心臟的供血供氧,但血液中的白細胞等可以通過大量釋放MPO 和MDA 等炎性因子引起缺血心肌再灌注損傷。IL-1主要是由白細胞，特別是由中性粒細胞和單核細胞合成分泌的一種重要的前炎性細胞因子。IL-1能夠通過分泌-促分泌反饋環(huán)路機制參與白細胞活化的炎性過程,包括直接激

29、活白細胞和先激活心血管組織的ICAM-1表達而間接作用于白細胞7；IL-1還可以直接激活花生四烯酸代謝途徑,誘導白細胞產(chǎn)生大量活性氧作用于心肌細胞膜引起脂質(zhì)過氧化,導致心肌組織損傷加重8。IL-8是趨化白細胞向缺血心肌聚集和移行的關(guān)鍵因子,它對白細胞的趨化作用具有高度的選擇性9。IL-8作為白細胞的重要趨化蛋白之一,不僅能夠促進外周血白細胞數(shù)目迅速增加10,還參與了心肌缺血再灌注損傷11。本研究中,心肌缺血60min 時IL-1和IL-8濃度明顯升高,主動脈開放后,IL-1和IL-8濃度升高更為顯著；提示, CPB 期間諸多因素如缺血再灌注等均可啟動炎性信號傳導引起活化白細胞、心肌細胞等合成和

30、釋放IL-1和IL-812，13，活化白細胞不僅能夠釋放IL-1，還于血流再灌注過程中刺激缺血心肌釋放IL-812,從而使炎性細胞因子生成和釋放增加,引起心臟急性炎性反應,而發(fā)生炎性反應的心臟心功能恢復延遲, 心輸出量下降, 說明IL-1、IL-8與白細胞的協(xié)同效應在心肌缺血再灌注損傷過程中起著重要的作用。 本研究觀察到CPB 期間LDF 對動脈血中白細胞的祛除效果較好,濾除率高達90以上,去白細胞再灌注血液中白細胞計數(shù)較動脈血顯著減少。研究證實,去白細胞血再灌注的心肌保護作用顯著優(yōu)于全血再灌注2，3，4；而IL-1和IL-8濃度持續(xù)升高與肌鈣蛋白-I顯著相關(guān)14，15,與術(shù)后心臟指數(shù)呈負相關(guān)

31、16,與術(shù)后心功能惡化關(guān)系密切17。本研究中,開放升主動脈前使用LDF 濾除動脈血中白細胞，IL-1和IL-8濃度較對照組和全血組明顯減低,再灌注后心肌MPO 活性和MDA 含量也明顯下降,且血液動力學指標恢復迅速,說明開放升主動脈前使用濾除白細胞的新鮮動脈血灌注缺血心臟不僅有效地清除了蓄積在心肌的代謝產(chǎn)物,并為缺血心臟供血、供氧和提供能量,使心肌組織的氧化代謝盡早恢復,還通過最大限度地減輕活化白細胞對缺血心臟的危害、間接減少了白細胞產(chǎn)生的IL-1和抑制缺血心肌組織炎性反應信號傳導系統(tǒng)合成釋放IL-85，6等途徑,對減輕心臟局部炎性反應引起的炎性損傷起到重要作用,阻止了心肌缺血性損害的延續(xù)并促

32、使其損傷的修復以及預防再灌注損傷的發(fā)生,從而對缺血心臟產(chǎn)生較為有效的保護作用。本研究結(jié)果表明，促炎性細胞因子的產(chǎn)生、白細胞活化以及缺血心肌再灌注損傷三者之間存在著密切的聯(lián)系。對于缺血心臟，通過控制再灌注條件和再灌注液成分能夠產(chǎn)生心肌保護作用，而直接濾除再灌注血液中活化的白細胞、延長去白細胞血的灌注時間和間接抑制促炎性細胞因子IL-1和IL-8等的產(chǎn)生可以減輕缺血心肌的再灌注損傷。參考文獻：1 Gessler P, Pfenninger J, Pfammatter JP, et al. Inflammatory response of neutrophil 組別 阻斷前開放30min開放60mi

33、nCO(L/min對照組 1.23±0.13 0.79±0.06* 0.90±0.05* 全血組 1.18±0.09 0.10±0.05* 0.33±0.08* 去白組1.20±0.120.56±0.090.84±0.13CI(L/min-1.m -2對照組 2.19±0.22 1.35±0.11*1.55±0.09* 全血組 1.85±0.31 0.17±0.09* 0.56±0.14* 去白組 2.02±0.190.95±

34、0.15*1.43±0.22SV(ml/beat對照組 10.61±1.12 5.64±0.43* 7.26±0.41* 全血組 10.17±0.78 1.21±0.64* 2.02±0.53* 去白組9.35±0.914.63±0.74*7.57±1.17granulocytes and monocytes after cardiopulmonary bypass in pediatric cardiac surgery. Intensive Care Med. 2002 Dec;28(12:

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