殼聚糖納米?；蜉d體的制備和體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究

1、殼聚糖納米?；蜉d體的制備和體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究         10-10-29 14:36:00     編輯：studa20                         作者：王紅梅，肖玉潔，韓正祥，高向陽(yáng)3，裴冬生，杜秀平【摘要】&

2、#160; 目的 制備基因載體殼聚糖納米粒，研究其結(jié)構(gòu)特征及其體外對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染活性。方法 以復(fù)凝聚法制備殼聚糖-pDNA納米粒;電鏡測(cè)定其形態(tài)、粒徑;凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)觀察殼聚糖和pDNA的結(jié)合力;紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其負(fù)載力、負(fù)載率;體外轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞293T，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，CCK8法評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。結(jié)果 殼聚糖-pGFP 納米粒多呈球形，直徑為(132±48)nm;凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)示pGFP被完全包裹在納米粒內(nèi);其負(fù)載力(LC)為(48.2±2.0)%，負(fù)載率(LE)為100%;體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明殼聚糖-pGFP納米粒能介導(dǎo)pGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)

3、綠色熒光蛋白;殼聚糖-pDNA抑制率(26.08±4.28)%。結(jié)論 采用復(fù)凝聚法制備的殼聚糖-pDNA納米?？捎行мD(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，但有一定的細(xì)胞毒性。 【關(guān)鍵詞】  殼聚糖;納米粒;基因載體;轉(zhuǎn)染Abstract:Objective To prepare chitosan nanoparticles as gene vectors so as to investigate their structural characteristics and cell-gene transfection efficiency in vitro.Methods The chitosan-p

4、DNA nanoparticles were prepared by a complex coacervation method and their morphology as well as the particle diameter were observed under the electronic microscope. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis; the loading capacity and loading efficiency were determined

5、 with UV/Vis spectrophotometer. The transfection experiments were performed with human embryonic kidney 293T cell line in vitro. The transfection efficiency was measured under fluorescent microscope. The cytotoxicity was observed with Cell Counting Kit-8 (CCK-8).Results The chitosan-pDNA nanoparticl

6、es were mainly spherical, with an average diameter of (132±48)nm. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed the DNA was wholly encapsulated in the nanoparticles. The loading capacity was (48.2±2.0)% and loading efficiency was 100%. Transfection in vitro proved that chitosan-pDNA w

7、as efficient in 293T cells and the expression of green fluorescent proteins was observed under fluorescent microscope. The inhibition percentage of nanoparticles was (26.08±4.28)%.Conclusions The chitosan-pDNA nanoparticles can be effectively transfected into cells. A certain degree of cytotoxi

8、city was observed by CCK8, though.Key words： chitosan; nanoparticles; gene vector; transfection基因治療為近年研究熱點(diǎn)，高效低毒的載體為基因治療的關(guān)鍵1。殼聚糖作為一種聚陽(yáng)離子基因載體，是由葡糖胺和N- 乙酰基葡糖胺構(gòu)成的生物共聚物，有較好的生物相容性和生物可降解性，免疫原性低，毒性小;而且殼聚糖易于和帶負(fù)電荷的DNA形成納米級(jí)復(fù)合物，能有效保護(hù)DNA免受核酸酶的降解2。目前被認(rèn)為是很有潛力的基因遞送載體3。本研究以殼聚糖作為載體，制備殼聚糖-pDNA納米粒，觀察其結(jié)構(gòu)特征，并在細(xì)胞水平上測(cè)定其轉(zhuǎn)染效

9、果。1 材料和方法1.1 材料 殼聚糖(分子式：C12 H24 N2O9,分子質(zhì)量：340)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen 公司，293T人胚胎腎細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒PGPU6/GFP/Neo-shNC購(gòu)自上海吉瑪公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 293T人胚胎腎細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清、1×108 U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640+HEPES培養(yǎng)液中，置于37、5%二氧化碳培

10、養(yǎng)箱培養(yǎng)。每35天按1315的比例進(jìn)行傳代。1.2.2 殼聚糖-質(zhì)粒(pDNA)微粒體的制備(復(fù)凝聚法) 取殼聚糖500 mg，溶解于1%乙酸溶液，濃度0.5%(pH 4.5)，超聲震蕩至澄清，121，高壓滅菌20 min備用。 pDNA溶解于滅菌20%Na2SO4溶液中，濃度為25 mg/L。取0.5%的殼聚糖與等體積的pDNA溶液混合，在漩渦混合器上充分混勻后，12000 r/min、4離心20 min， 沉淀物以PBS重懸，此為殼聚糖-pDNA微?；鞈乙?。1.2.3 殼聚糖-pDNA納米粒的形態(tài)和粒徑測(cè)定 取少量殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙?，滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置2 min，用濾紙吸

11、干混懸液，再滴加1%(W/V)磷鎢酸復(fù)染2 min，于透射電子顯微鏡下觀察微粒形態(tài)并拍照。1.2.4 殼聚糖-pDNA納米粒凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn) 分別取裸pDNA液、殼聚糖-pDNA混懸液、殼聚糖液及制備殼聚糖-pDNA混懸液離心后上清液20 l，以1%瓊脂糖凝膠水平電泳實(shí)驗(yàn)。1.2.5 殼聚糖包封pDNA測(cè)定 將制備的殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙罕M可能吸盡上清液，凍干、稱重，標(biāo)記為W0。收集上清液，UV法在波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定上清液未結(jié)合pDNA濃度，標(biāo)記為Ws。將制備微粒時(shí)pDNA加入量記為WpDNA。按下列公式計(jì)算負(fù)載力(loading capacity, LC)及負(fù)載率(loading

12、efficiency, LE)：LC=(WpDNA-Ws)/W0×100%, LE=( WpDNA-Ws) /WpDNA×100%。1.2.6 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將293T細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種6×105個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞約24 h(細(xì)胞融合60%70%)，使細(xì)胞達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。設(shè)立殼聚糖-pDNA孔、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000陽(yáng)性對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、空白孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。吸盡舊培養(yǎng)基，將殼聚糖-pDNA納米?；鞈乙?00 l(質(zhì)粒2.5 g/孔)加入殼聚糖-pDNA孔中，同時(shí)制備500 l脂質(zhì)體-pDNA復(fù)合物加入陽(yáng)性對(duì)照孔中，陰

13、性對(duì)照孔中放入500 l殼聚糖懸液，再每孔加入1.5 ml無(wú)血清培養(yǎng)基。十字搖勻法混勻，放回CO2培養(yǎng)箱孵育，46 h后換成有血清的培養(yǎng)基。2472 h，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光。1.2.7 CCK8實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期293T細(xì)胞接種于96孔板,每孔1×104個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合至60%70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)殼聚糖-pDNA孔、脂質(zhì)體-pDNA孔、殼聚糖孔、空白孔。轉(zhuǎn)染方法同前，質(zhì)粒為0.1 g/孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后，每孔加CCK-8試劑10 l,再培養(yǎng)4 h。在酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定， 波長(zhǎng)450490 nm，參比波長(zhǎng)600650 nm，測(cè)D值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率

14、=(D試驗(yàn)組-D空白組)/(D對(duì)照組-D空白組)×100 %，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-細(xì)胞存活率)×100 %。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 定量資料用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)：=0.05。2 結(jié) 果2.1 殼聚糖-pDNA納米粒的形態(tài)和粒徑 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果表明，殼聚糖-pDNA納米粒多呈球形(圖1)，按放大倍數(shù)計(jì)算，微粒直徑在100200 nm之間，平均約(132±48)nm。圖1 殼聚糖-pDNA納米粒電鏡照片(×20000)2.2 殼聚

15、糖-pDNA納米粒凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn) 凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2。殼聚糖-pDNA納米粒能阻滯pDNA向陽(yáng)極移動(dòng)，使pDNA滯留于加樣孔中而發(fā)亮，表明pDNA與殼聚糖之間通過靜電作用有效凝聚。殼聚糖孔和離心后上清液孔均未見到發(fā)亮的pDNA。圖2 殼聚糖-pDNA納米粒凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)1.裸pDNA;2，3.殼聚糖-pDNA納米粒;4.殼聚糖;5.離心后上清液; 6、7. DNA Marker2.3 殼聚糖包封pDNA測(cè)定 應(yīng)用UV法測(cè)定上清液中未結(jié)合pDNA濃度，在260 nm處為負(fù)值，pDNA濃度為負(fù)值，經(jīng)計(jì)算殼聚糖LC為(48.2±2.0)%，LE為100%，表明殼聚糖完全包封pDNA。2.4 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染24 h觀察，脂質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有散在的綠色熒光點(diǎn)，殼聚糖質(zhì)粒組無(wú)熒光點(diǎn)。48 h時(shí)觀察，脂質(zhì)體組熒光明顯增多，亮度增加，殼聚糖質(zhì)粒組散在綠色熒光，亮度弱，部分細(xì)胞脫壁死亡(圖3 6)。72 h觀察熒光均減少，殼聚糖質(zhì)粒組死亡細(xì)胞增多，脂質(zhì)體質(zhì)粒組細(xì)胞狀