姜黃素固體脂質(zhì)納米粒制備及理化性質(zhì)研究

1、姜黃素固體脂質(zhì)納米粒制備及理化性質(zhì)研究鄧睿園 1，宋金春2,呂樺1（1.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430072；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430060）摘 要 目的: 以姜黃素為模型藥物，山崳酸甘油酯為載體材料制備姜黃素固體脂質(zhì)納米粒，并考察其質(zhì)量和性質(zhì)。方法：用乳化蒸發(fā)一低溫固化技術(shù)制得了姜黃素固體脂質(zhì)納米拉，以單因素考察和正交設(shè)計(jì)法篩選處方和工藝, 并對(duì)其形態(tài)、粒徑、表面電位、包封率、體外釋藥特等進(jìn)行了研究。結(jié)果: 所得脂質(zhì)納米粒為類圓球狀,粒徑分布較均勻。樣品粒徑為(134±5)nm,包封率為(67.4±1.3)%,平均Zeta電位值為(-23.5

2、77;1.5)mV。藥物體外釋放符合Higuchi方程。結(jié)論: 選擇乳化蒸發(fā)低溫固化法制備姜黃素固體脂質(zhì)納米粒方法可行,為開(kāi)發(fā)姜黃素新型注射制劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞 姜黃素；固體脂質(zhì)納米粒；乳化蒸發(fā)低溫固法；理化性質(zhì)Preparation and Physico-chemical Property of Curcumin solid lipid nanoparticlesDENG rui-yuan1,SONG Jin-chun2, LV hua 1 (1.College of pharmacy, Wuhan university, Wuhan 430072, China ；2.Departm

3、ent of pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan university, Wuhan 430060,china)ABSTRACT：OBJECTIVE To prepare the Curcumin solid lipid nanoparticles with docosanoic acid glycerol ester and investigate their quality and characteris .METHODS The method of emulsification evaporation- solidification at low tem

4、perature was used to the solid lipid nanoparticles (SLN) containing curcumin. the formula and technology were optimized by the single factor exploration and orthogonal design. Its morphology and particle size were examined by transmission electron microscope. Entrapment efficiency, Zeta potential, a

5、nd the release of curcumin in vitro were studied. RESULTS The Cur -SLN assumed spherical shape.Its distribution of diameter was even with average particle size (134±5) nm. Entrapment efficiency was (67.4±1.3)%. The Zeta potential was(-23.5±1.5)mV . The release of curcumin in vitro con

6、formed to Higuchi Equation. CONCLUSION: The selected preparation technique of Cur-SLN is rational and practicable. It provides experimental evidence for developing a new curcumin injection.KEY WORDS :curcumin; solid lipid nanoparticles; emulsion evaporation-solidification at low temperature; Physico

7、-chemical property姜黃素(Curcumin)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥姜黃(Curcumin long L.)的主要活性成分，近年來(lái)，對(duì)姜黃素抗癌作用的實(shí)驗(yàn)研究表明,姜黃素可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)1，且抗癌譜廣,毒副作用小,是一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌新藥。但姜黃素水溶性差，在機(jī)體內(nèi)難吸收，易代謝（口服生物利用度低,大部分以原形排出體外約89%)在體外也容易被氧化2，由于上述原因，為姜黃素的臨床應(yīng)用帶來(lái)了一定的難度。因此需要進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)姜黃素的新劑型，以提高其溶解度，增強(qiáng)其藥理作用。 本試驗(yàn)研制的姜黃素固體脂質(zhì)納米粒（Cur-SLN），以固態(tài)的天然或合成類脂為載體，將藥物包裹于類脂核中，減

8、少了姜黃素與水分散相及外界環(huán)境的接觸,提高了姜黃素的穩(wěn)定性，同時(shí)解決了姜黃素不易溶于水的難題。為開(kāi)發(fā)姜黃素穩(wěn)定性好的，靜脈注射給藥新劑型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 儀器和材料Agilent 1100型高效液相色譜儀，配四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、G137PA自動(dòng)脫氣機(jī)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱色譜工作站(美國(guó)Agilent公司)；UV2800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；Zeta電位P動(dòng)態(tài)激光粒度分析儀(BrookHaven)；JEM-1200EX型透射電鏡(日本電子)；TG328A型電子分析天平(上海天平儀器廠)；SHJ-A水浴恒溫磁力攪拌器（江蘇金壇市金南儀器廠）；卵磷脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試

9、劑有限公司 批號(hào) 20080129）；姜黃素原料藥（分析純，上海三愛(ài)思試劑有限公司，批號(hào)：20060712）姜黃素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-20060209）；山崳酸甘油酯（四川西普化工股份有限公司，批號(hào)：45070401）；泊洛沙姆188 (德國(guó)BASF公司,批號(hào)：WPHC625E)；甲醇（色譜純），乙腈（色譜純）（美國(guó)TEDIA公司）；其他試劑均為分析純(市售)。2 方法和結(jié)果2.1納米粒的制備取處方量的姜黃素、山崳酸甘油酯、卵磷脂和10 mL乙醇置于25 mL梨形瓶中，于80的恒溫水浴上加熱使其充分溶解,構(gòu)成有機(jī)相。另取泊洛沙姆188溶于30 mL水中，水浴加熱

10、至和有機(jī)相相同的溫度，構(gòu)成水相，將有機(jī)相在1000r/min攪拌下注人水相中，溫度保持在(80±2)，攪拌使有機(jī)溶劑完全蒸發(fā)并使體系濃縮至約5 mL，可得黃色半透明納米乳劑。將所得納米乳劑在攪拌(1000r·min-1)下快速混于0-2的水中，繼續(xù)攪拌2h即得姜黃素固體脂質(zhì)納米粒的混懸液。2.2 Cur-SLN的形態(tài)學(xué)及粒徑,Zeta電位考察取Cur-SLN混懸液適量,加適量蒸餾水稀釋, 然后滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，2.0%磷鎢酸鈉溶液負(fù)染，在透射電鏡下觀察粒徑大小和形態(tài)并拍攝照片。結(jié)果，所制得的納米粒為類球形實(shí)體粒子,且粒徑均勻。透射電鏡圖詳見(jiàn)圖1。取新鮮制備的Cur-S

11、LN樣品,加水稀釋至適當(dāng)濃度,用激光散射粒度測(cè)定儀測(cè)定其粒徑,及Zeta電位，得平均粒徑為(134±5)nm,且粒徑分布較窄,基本呈正態(tài)分布。粒徑分布詳見(jiàn)圖2。Zeta電位平均值為(-23.5±1.5)mV。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道3，4，易發(fā)生團(tuán)聚的系統(tǒng)電位在2011mV。Zeta電位結(jié)果表明本試驗(yàn)室制備的SLN的穩(wěn)定性良好。 圖1 Cur-SLN的透射電鏡照片 (×29000) 圖2 Cur-SLN的粒徑分布圖 Fig.1 Electron microscope photo of Cur- SLN Fig.2 The size distribution of Cur-SLN

12、2.3 藥物含量測(cè)定2.3.1 色譜條件 色譜柱為：ZORBAX SB-C18柱（5m，4.6×250mm）；流動(dòng)相:甲醇:乙腈:（5%醋酸）=55%:20%:25% 流速:1.0mL·min-1; 檢測(cè)波長(zhǎng):433nm; 進(jìn)樣量:20L2.3.2 色譜條件專屬性試驗(yàn)色譜條件：同2.3.1姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品：3.2g·mL-1的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)液(A) ； Cur-SLN樣品溶液：取Cur-SLN0.5mL置于50mL量瓶中，以甲醇定容（B）；空白對(duì)照液：取空白納米粒0.5mL置于50mL量瓶中，以甲醇定容(C)。結(jié)果表明：輔料對(duì)Cur-SLN樣品中姜黃素測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖詳

13、見(jiàn)圖3。 (A) (B) (C)圖3 HPLC色譜圖：(A ) Cur標(biāo)準(zhǔn)品；(B) Cur-SLN；（C）空白SLNFig.3 HPLC：（A）Cur ;（B）Cur-SLN; (C) blank SLN2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品2mg，置25 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容，得姜黃素儲(chǔ)備液。精密吸取不同體積的儲(chǔ)備液，稀釋成濃度分別為32，16，8，3.2，0.8,0.2 g·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20L進(jìn)行色譜分析,以峰面積(A)為縱坐標(biāo),藥物濃度(C)為橫坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=4.752+132.3C (R=0.9999 )。結(jié)果表明姜黃素在(0

14、.2-32g·mL-1)濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。2.3.4 回收率試驗(yàn)分別精密吸取80g·mL-1溶液0.1mL1mL4mL,置于10mL容量瓶中,各加入0.5mL空白SLN,加甲醇適量,超聲溶解,室溫甲醇定容,配成藥物濃度分別為0.8832 g/mL溶液。每種濃度平行測(cè)定3次,分別與在相同色譜條件下測(cè)得的相應(yīng)濃度Cur對(duì)照品的峰面積對(duì)比。結(jié)果計(jì)算其 絕對(duì)平均回收率依次為103.4% (RSD=0.61%,n=3)、102.2%(RSD=0.70%,n=3)、99.74%(RSD=1.06%,n=3)。2.3.5 精密度試驗(yàn)取上述樣品溶液,一日內(nèi)3次,測(cè)定日內(nèi)精密

15、度;每日測(cè)定一次,連續(xù)測(cè)3d,測(cè)定日間精密度。經(jīng)計(jì)算低、中、高3種不同濃度的日內(nèi)RSD(%)值依次為0.23、1.65、0.18;日間RSD(%)值依次為1.89、0.89、0.21。上述結(jié)果表明,該分析方法的回收率和精密度均符合方法學(xué)要求。2.4 包封率的測(cè)定 吸取0.5 mLCur-SLN混懸體系上葡聚糖凝膠G-50(Sephadex G-50)柱，用蒸餾水洗脫，接取帶乳光流分, 甲醇定容到50mL，再精密量取5mL加甲醇定容至10 mL；另取0.5 mL樣品直接加甲醇溶解并定容到50mL，移取5mL用甲醇定容到l0 mL。將2種樣品分別用HPLC測(cè)定出Cur的含量后，按下式計(jì)算包封率。包

16、封率=W包W 總 (W包為Cur-SLN混懸液通過(guò)Sephadex G-50后測(cè)得的姜黃素含量；W總為Cur-SLN混懸液直接破乳定容后測(cè)得的姜黃素)。2.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)及方差分析在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，投藥量，乳化劑和載體材料的用量對(duì)包封率有較大的影響。因此，選擇投藥量(A)、泊洛沙姆188 ( B)、山崳酸甘油酯(C)和卵磷脂(D)的用量4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定4因素3水平，以包封率為考察指標(biāo)，按L9(43)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)，篩選最佳處方組成和制備工藝。因素水平與正交試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1和表2。表1正交設(shè)計(jì)的因素和水平Tab. 1Factors and level

17、s of orthogonal designfactorsABCDLevels(mg)投藥量泊洛沙姆188山崳酸甘油酯卵磷脂1614014020028200200320310320260400 表2正交試驗(yàn)的結(jié)果 Tab. 2Results of orthogonal experimentNO.ABCDEN（%）1111127.82122240.13133354.34212340.05223141.66231267.47313223.68321328.29332137.9K140.7330.4741.1335.77K249.6736.6339.3343.70K329.9053.2039.834

18、0.83R19.7722.731.807.93 表3方差分析結(jié)果Tab. 3Results of variance analysis因素偏差平方和自由度均方FPA587.92293.9113.5<0.05B829.32414.6160.1<0.05C5.18022.5901.000>0.05D96.83248.4218.69>0.05誤差5.18022.590注:根據(jù)直觀分析法的結(jié)果,以C因素作為誤差列進(jìn)行方差分析, F0. 05(2, 2)=19由表2中的極差值R可得知各因素影響的主次順序是B>A>D>C，說(shuō)明泊洛沙姆188用量, 主藥量,卵磷脂用量

19、及山崳酸甘油酯用量的影響依次減弱。由方差分析的結(jié)果得知A、B因素有顯著影響(P<0. 05),C、D因素?zé)o顯著性影響(P>0. 05)。選取顯著因素的最高水平,并綜合直觀分析的結(jié)果,初步確定最佳處方為由此得出各因素的最優(yōu)化組合A2B3C1D2。最佳處方：主藥用量8mg, 泊洛沙姆188用量320mg , 山崳酸甘油酯140mg, 卵磷脂用量320mg。2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)按照優(yōu)化后的處方制備3批Cur-SLN,測(cè)定粒徑，Zeta電位和包封率,結(jié)果見(jiàn)表4。表4Cur-SLN的平均粒徑, Zeta電位和包封率Tab. 4Mean size，Zeta potential and the e

20、ncapsulation efficacy of Cur-SLNNod(粒徑) /nmU(Zeta電位) /mV包封率/%1129-23.566.32138-25.068.73136-22.167.1134±5-23.5±1.567.4±1.32.7體外釋放度取Cur-SLN制劑2m L，置于透析袋中，除去袋內(nèi)氣泡，固定于200m L的0.5%吐溫80生理鹽水中，袋上沿距液而約lcm, 釋放介質(zhì)的溫度控制在(37±0. 5)，置于電磁攪拌器中速攪拌，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣2mL，然后補(bǔ)加相同體積的釋放介質(zhì)。將樣液過(guò)濾(0. 45m) , 取過(guò)濾液20uL進(jìn)

21、樣，HPLC測(cè)定釋放介質(zhì)中藥物濃度，計(jì)算累積釋放率。結(jié)果見(jiàn)圖4。 圖4 Cur-SLN的體外釋藥曲線Fig.4 Releasing curves of Cur-SLN in vitro結(jié)果表明，在釋放條件下，前12時(shí)釋藥速率較快，隨后緩慢釋放，經(jīng)過(guò)96h藥物累計(jì)釋放約80%.把累計(jì)釋放度與時(shí)間的平方根( t1/2)回歸，發(fā)現(xiàn)兩者有明顯的相關(guān)性。Cur-SLN的釋藥符合Higuchi方程Q=7.778t1/2+5.159(R=0.9930)。3 討論3.1 姜黃素分子結(jié)構(gòu)中含有雙鍵，酚羥基及羥基等多個(gè)活性基團(tuán)，其化學(xué)反應(yīng)性較強(qiáng)。故在選擇處方中的其它成分，考察制備條件時(shí)都應(yīng)該不影響姜黃素的穩(wěn)定性。

22、據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道5大豆卵磷脂的不飽和脂肪酸含量和脂肪酸的不飽和度高，容易被氧化，對(duì)姜黃素的穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生較大影響。故本試驗(yàn)選擇蛋黃卵磷脂。3.2 載體材料山崳酸甘油脂的熔點(diǎn)為：69-74，制備過(guò)程的溫度應(yīng)高于此。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期考察姜黃素光、熱穩(wěn)定性，及單因素考察制備工藝的結(jié)果，確定80避光條件下乳化2h,不影響姜黃素的穩(wěn)定性。3.3 在低溫固化納米粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，固化降溫過(guò)程應(yīng)該迅速，降溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致微乳液滴的聚集，使形成的粒子粒徑增大，而納米粒體系的穩(wěn)定性下降。固化過(guò)程溫差越大，納米粒越不易粘連，越有利于脂質(zhì)的固化6。3.4 本試驗(yàn)選用山崳酸甘油脂為載體制備的Cur-SLN具有較高的包封率，原因可能：

23、在熔融狀態(tài)下，載體材料與藥物的相容性較好；山崳酸甘油脂是二十二烷酸的單甘脂、雙甘脂及三甘脂的混和物，與單一脂質(zhì)材料為載體相比，能提高包分率7。3.5 研究該類制劑體外釋放時(shí)，為模擬體內(nèi)條件，常選pH7.4的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水做釋放介質(zhì)。由于Cur在堿性條件下穩(wěn)定性差8故本實(shí)驗(yàn)選擇生理鹽水作釋放介質(zhì)。但Cur難溶于水，為達(dá)到漏槽條件，可在介質(zhì)中加入一定的表面活性劑以增大其在水中的溶解度。綜合考慮不同表面活性劑對(duì)姜黃素穩(wěn)定性的影響8最終確定以含0.5% Tween80的生理鹽水作釋藥介質(zhì)。3.6 Cur-SLN的體外釋藥曲線符合Higuchi方程，釋放過(guò)程可分為兩個(gè)階段 ：前期釋藥速率較快，可

24、能原因是藥物分子一部分吸附在納米粒的表面，或者富集在納米粒的外層。而納米粒表面也結(jié)合了較多表面活性劑，有利于表面藥物的溶出。后期藥物釋放速度緩慢，可能藥物以固態(tài)溶液的形式分散在脂質(zhì)中，藥物隨著脂質(zhì)材料的的熔融而釋放，故表現(xiàn)為持續(xù)，緩慢的釋藥過(guò)程。REFERENCES1 XU DH,WANG S,JIN J, et al. Advances in studies on pharmacological effect of curcuminJ. Chinese Traditional and Herbal Drubs (中草藥),2005,36(11):1737-1740.2 WANG Q ,WANG K. Metabolism of curcuminJ. Chinese Pharmacological Bulletin(中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)),2003,19(10):1097-11013 Zimmermann E，Muller R H.Electrolyte-and pH-stabilities of aqueous solid lipid nano