尼莫地平對帕金森病模型小鼠黑質多巴胺神經(jīng)元的保護作用

1、    尼莫地平對帕金森病模型小鼠黑質多巴胺神經(jīng)元的保護作用 周洪霞1，蒙國光1，桓秀杰2，李會2，張作鳳1，魏子峰1，張宇新1*(華北煤炭醫(yī)學院：1.解剖學教研室，2.附屬醫(yī)院，唐山 063000)摘 要 目的：研究尼莫地平在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠中對黑質多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。方法：雄性健康C57BL/6N小鼠隨機分為對照組，腹腔注射生理鹽水;模型組，腹腔注射MPTP(25 mg/kg);尼莫地平治療組，每次注射MPTP前3 h灌胃給予尼莫地平(15 mg/kg)。觀察各組小鼠行為學變化，

2、免疫組織化學和免疫蛋白印跡法觀察中腦黑質酪氨酸羥化酶(TH)、前列腺素E2(PGE2)和腫瘤壞死因子a(TNF-a)的表達變化。結果：與對照組小鼠比較，MPTP模型組小鼠出現(xiàn)典型的PD癥狀，中腦黑質TH陽性神經(jīng)元大量丟失，PGE2和TNF-a陽性細胞顯著增多，蛋白水平明顯升高;經(jīng)尼莫地平治療后，上述癥狀得到明顯改善。結論：在MPTP所致PD小鼠模型中，尼莫地平通過抑制炎癥因子PGE2和TNF-a的表達從而對多巴胺能神經(jīng)元具有一定的保護作用。關鍵詞 帕金森病;酪氨酸羥化酶;前列腺素E2;腫瘤壞死因子-a;尼莫地平;小鼠 Nimodipine protects dopaminergic neuro

3、ns in the mouse modelof Parkinsons diseaseZhou Hongxia1,Meng Guoguang1,Huan Xiujie2,Li Hui2,Zhang Zuofeng1,Wei Zifeng1,Zhang Yu-xin1(1.Department of Anatomy, 2. Affiliated Hospital, North China Coal Medical College, Tangshan 063000, China)Abstract Objective: To investigate the protective effect of n

4、imodipine on the dopaminergic neurons in the substania nigra(SN)of MPTP-induced mouse model of Parkinsons disease(PD). Methods: Healthy male C57BL/6N mice were randomly divided into three groups:control group which was treated with saline; model group which was injected with MPTP intraperitoneally;

5、nimodipine group which was treated with nimodipine before injection of MPTP. The behavioral changes of different groups were observed, immunohistochemistry and Western Blot methods were used to investigate the positive cell numbers and the protein expression of PGE2, TNF-a and TH. Results: Compared

6、with control group, the MPTP model group showed typical symptoms of PD with marked loss of tylosine hydroxylase(TH)-positive neurons, the expression level of PGE2 and TNF-a increased significantly. After treating with nimodipine, the above changes were allevated obviously. Conclusion: In the mouse m

7、odel of Parkinsons disease induced by MPTP, nimodipine may play a protective role on the dopaminergic neurons by inhibiting inflammation factors of PGE2 and TNF-a.Key words Parkinsons disease; tylosine hydroxylase; prostaglanclin E2; tumor necrosis factor-a; nimodipine; mouse帕金森病(Parkinsons disease,

8、 PD)的顯著病理特征為中腦黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性丟失，至今病因未明。研究認為，腦內(nèi)炎癥反應可能是PD發(fā)病的主要誘發(fā)因素，病例對照研究和流行病學調查也證實早期腦外傷或者腦部炎癥與后來發(fā)展為PD有關1。腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-a,TNF-a)與前列腺素(E2 Prostaglandin E2, PGE2)作為重要的炎癥因子可能參與了PD發(fā)病2,3。尼莫地平作為鈣通道拮抗劑，主要用于治療心腦血管疾病。近年研究顯示，尼莫地平對許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有較好的療效。體外模型中，尼莫地平能減輕炎癥的產(chǎn)生，從而對多巴胺能神經(jīng)元起到保護作用。為明確尼莫地平是否能減少T

9、NF-a和PGE2表達，本實驗以MPTP制備小鼠模型，探討尼莫地平對多巴胺神經(jīng)元的可能保護作用。材料和方法1 材料雄性健康C57BL/6N 小鼠45只，1214 周齡，體質量 2530 g，清潔級，購于北京維通利華公司，自由進食，飲水，室溫25±2°C，單籠喂養(yǎng)。MPTP(Sigma，USA);兔抗人PGE2單克隆抗體(CANYAN, USA);兔抗鼠TNF-a多克隆抗體，預染蛋白Marker(天津灝洋生物公司);大鼠抗TH單克隆抗體(Chemicon，USA);尼莫地平(德國拜耳醫(yī)藥);UltraSensitive SP超敏試劑盒(福州邁新公司)。2 方法2.1 動物分組

10、和模型制備 實驗動物隨機分為3組，每組15只。模型組：腹腔注射MPTP(25 mg/kg，生理鹽水溶解)，每天1次，連續(xù)7 d;尼莫地平治療組：在MPTP注射前3 h灌胃給予尼莫地平預處理(15 mg/kg)，每天1次，連續(xù)7 d;對照組：注射與模型組等量生理鹽水。2.2 組織固定、取材和切片 MPTP第7 次注射后12 h 每組隨機取9只C57BL/6N小鼠。腹腔麻醉后，經(jīng)左心室插管用生理鹽水(室溫)灌注，再用4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取中腦黑質部位腦塊，放于4%多聚甲醛后固定48 h(4°C)，固定好的腦組織經(jīng)蒸餾水沖洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，

11、包埋后，石蠟切片機做連續(xù)冠狀切片，片厚5 mm，4°C保存?zhèn)溆?。每組15只小鼠中隨機取6只進行免疫蛋白印跡分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離中腦黑質部分，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，4°C震蕩30 min后，12 000 r/min ，4°C離心15 min，取上清液，-80°C保存?zhèn)溆谩?.3 免疫組織化學 免疫組織化學染色采用SP法，步驟如下：切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后，用TBS(pH 7.4±0.2)洗3次，每次5 min;組織切片進行水浴法抗原修復;降至室溫;TBS洗3次，每次5 min;每張切片加入過氧化氫(25 ml)阻斷內(nèi)

12、源性過氧化物酶，TBS洗3次，每次5 min;每張切片滴加10%正常山羊血清(25 ml)室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗人PGE2單克隆抗體(1：150)，兔抗鼠TNF-a多克隆抗體(1：150)，大鼠抗TH單克隆抗體(1：300)，4 °C過夜，TBS洗3次，每次5 min;加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG, 1：150)室溫孵育20 min;TBS洗3次，每次5 min;加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液(25 ml)室溫孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。2.4 免疫蛋白印跡 蛋白定量后

13、取4倍體積樣品緩沖液，95°C變性10 min。蛋白上樣量為30 mg/lane,10% SDS-PAGE電泳,將蛋白電轉移至硝酸纖維膜上，依分子量大小切取條帶，加入封閉液室溫下震蕩2 h后，取相應條帶分別加入兔抗人PGE2單克隆抗體(1：300)，兔抗鼠TNF-a多克隆抗體(1：200)，大鼠抗TH單克隆抗體(1：400)，4°C過夜。室溫孵育1 h后，TBST洗5次，每次3 min;分別加入二抗(生物素標記羊抗兔IgG, 1：500)室溫孵育1 h，TBST洗5次，每次3 min;加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h，TBST洗5次，每次3 min;

14、DAB顯色,掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。2.5 爬桿實驗 為了測定尼莫地平對模型小鼠的保護作用，MPTP第7次注射后進行爬桿實驗。將一根長55 cm 直徑0.8 cm的木桿上纏以紗布以防止打滑，作為實驗爬桿。測試時將被測小鼠頭向上置于木桿頂端。分別記錄小鼠轉身時間(T-turn)和完全爬到桿底所需要的時間(T-LA)并作統(tǒng)計學分析。每只小鼠測3次取平均值。時間參數(shù)的延長反應小鼠運動功能損害的程度。統(tǒng)計學處理：免疫組織化學染色數(shù)據(jù)，采用CMIAS真彩醫(yī)學圖像自動分析系統(tǒng)進行陽性細胞記數(shù)。各組每只動物的3張腦片數(shù)值相加后取平均值。實驗結果使用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，q檢驗，

15、以P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義;免疫印跡法統(tǒng)計分析同上。結 果1 免疫組織化學檢測結果對照組小鼠中腦黑質區(qū)偶見TNF-a陽性細胞，PGE2陽性細胞較少;與對照組比較，模型組TNF-a和PGE2陽性細胞顯著增多，呈棕黃色，陽性顆粒位于胞漿中;對照組小鼠中腦黑質區(qū)可見大量TH陽性神經(jīng)元，排列整齊，神經(jīng)纖維密集，模型組TH陽性神經(jīng)元大量丟失;經(jīng)尼莫地平治療后，TH陽性神經(jīng)元丟失程度明顯減輕，TNF-a和PGE2陽性細胞較模型組顯著降低。圖像分析結果顯示差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，F(xiàn)ig.1，表 1)。2 Western Blot檢測結果Western Blot結果顯示，對照組TH

16、蛋白條帶著色最深，模型組條帶變窄，著色較淺;對照組TNF-a和PGE2蛋白條帶不明顯，模型組條帶略寬，著色最深;與模型組比較，經(jīng)尼莫地平治療后，TH蛋白條帶著色較深，TNF-a和PGE2蛋白條帶著色變淺。結果分析顯示，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，F(xiàn)ig.2 A-F)。3 爬桿實驗結果與對照組小鼠比較，模型組小鼠出現(xiàn)典型的PD癥狀，表現(xiàn)為豎毛、活動減少、震顫、運動變慢等特征，導致爬桿能力下降，爬桿所需時間顯著延長。經(jīng)尼莫地平治療后，小鼠運動功能得到一定改善，表現(xiàn)為爬桿時間明顯縮短。(P<0.05，F(xiàn)ig.2 G，表 2)Fig.1 Showing the PGE2, TNF-a

17、 and TH immunoreactive neurons in the midbrain of different groups. A, B, C: PGE2 positive neurons in the midbrain of control group, model group and nimodipine group, respectively. Scale bar=100 mm; D, E, F: TNF-a positive neurons in the midbrain of control group, model group and nimodipine group, r

18、espectively. Scale bar=200 mm; H, G, I: TH positive neurons in the midbrain of control group, model group and nimodipine group, respectively. Scale bar=200 mm.Fig.2 A Western Blot showing changes of PGE2 expression in the SN of the midbrain. B: The intensities of bands were represented as folds of c

19、ontrol group (n=6,aP<0.05 vs control group; bP<0.05 vs model group) .C: Western Blot showing changes of TNF-a expression in the SN of the midbrain. D: The intensities of bands were represented as folds of control group (n=6,aP<0.05 vs control group; bP<0.05 vs model group) .E: Western Bl

20、ot showing changes of TH expression in the SN of the midbrain. F: The intensities of bands were represented as folds of control group (n=6,aP<0.05 vs control group; bP<0.05 vs model group) .G: The effect of nimodipine on the pole test time (seconds) changes in different groups.討 論神經(jīng)毒素MPTP誘導的動物

21、神經(jīng)損傷無論在行為異常、運動障礙，還是在神經(jīng)病理、生物化學等方面都與人PD有共同特點。本實驗以MPTP制備小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)MPTP注射7 d后，模型小鼠出現(xiàn)姿勢異常、運動遲緩、震顫等PD樣癥狀。免疫組化染色顯示，與對照組比較，模型組小鼠中腦黑質區(qū)TH陽性神經(jīng)元大量丟失，同時炎癥因子TNF-和PGE2顯著表達，Western Blot結果亦顯示了同樣的趨勢。腦內(nèi)炎癥反應是多種神經(jīng)退行性疾病的病理特征，愈來愈多的研究認為，增高的炎癥因子可能會加劇病變區(qū)域原有的慢性炎癥病癥反應，最終造成帕金森病DA能神經(jīng)元進行性變性丟失4,5。研究發(fā)現(xiàn)，PD患者與對照組相比，其腦脊液和紋狀體部位TNF-出現(xiàn)明顯增

22、高6，PD動物模型中腦黑質區(qū)亦可見TNF-和PGE2大量表達，而抑制二者表達對DA能神經(jīng)元起到明顯保護作用7,8。以上這些證據(jù)均提示，炎癥因子TNF-和PGE2可能是導致DA能神經(jīng)元變性丟失的重要因素。目前，對PD的治療仍然是控制癥狀，左旋多巴為治療PD的首先藥物，但是長時間服用可產(chǎn)生嚴重副作用，并不能阻止DA能神經(jīng)元進行性變性丟失。有實驗證據(jù)表明，在動物模型中應用抗炎藥物可明顯減輕DA能神經(jīng)元丟失，改善模型動物PD癥狀，因此抗炎治療可能成為治療PD的重要方式9。尼莫地平是一種常用的治療腦血管疾病藥物，Li10等人報道，在體外細胞培養(yǎng)中尼莫地平能顯著減輕炎癥反應，從而對DA能神經(jīng)元起到保護作用

23、。但在PD動物模型中是否也存在同樣機制，目前未見相關報道。本實驗采用尼莫地平作為藥物干預，觀察了它對TNF-和PGE2表達的影響。實驗結果顯示，與模型組比較，尼莫地平治療組中腦黑質區(qū)TNF-和PGE2陽性細胞大幅減少，蛋白水平亦顯著下降，同時TH陽性神經(jīng)元丟失程度得到明顯減輕。由于MPTP損毀多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)，導致紋狀體多巴胺釋放減少從而出現(xiàn)PD癥狀。為了進一步證實尼莫地平的神經(jīng)保護作用，我們采用爬桿實驗對小鼠運動功能進行動態(tài)評估11。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)活動減少、震顫、運動變慢等特征，導致爬桿能力下降，爬桿所需時間顯著延長，與模型組比較，經(jīng)尼莫地平治療后爬桿時間明顯縮短，肢體

24、協(xié)調能力得到一定改善。Soderstrom等12報道，大鼠模型中尼莫地平可以有效減輕多巴胺能神經(jīng)元纖維缺失。也有研究發(fā)現(xiàn)，尼莫地平能顯著降低凋亡蛋白Bcl-2和P53表達，從而對多巴胺神經(jīng)元起到保護作用13。我們的實驗結果表明，在本實驗條件下，MPTP誘導了中腦黑質炎癥介質TNF-和PGE2活化，最終導致DA能神經(jīng)元變性丟失，尼莫地平降低TNF-和PGE2表達，使小鼠行為學得以改善，從而發(fā)揮一定的神經(jīng)保護作用。參 考 文 獻1Williams DB, Annegers JF, Koken E, et al. Brain injury and neurologic sequelae: a coh

25、ort study of dementia, Parkinsonism and amyetrphic lateral sclerosis J. Neurology, 1991, 41(5):1554-1557.2Zhao CH, Ling ZD, Newman MB, et al. TNF-alpha knockout and minocycline treatment attenuates blood brain barrier leakage in MPTP-treat miceJ. Neurobiol Dis, 2007, 26(1):36-46.3Carrasco E, Casper

26、D, Werer P. PGE(2) receptor EP1 renders dopaminergic neurons selectively vulnerable to low-level oxidative stress and direct PGE(2) neurotoxicityJ. J Neurosci Res, 2007,85(14):3190-3117.4Hartmann A, Hunot S, Hirsch EC. Inflammation and dopaminergic neuronal loss in Parkinsons disease: a complex matt

27、erJ. Exp Neurol, 2003,184(7):561-564.5Whitton PS. Inflammation as a causative factor in the aetiology of Parkinsons diseaseJ. Br J Pharmacol, 2007, 150(8):963-976.6Mogi M, Harada M, Riederer P, et al. Tumor necrosis factor-alpha(TNF-)increases both in the brain and in the cerebrospinal fluid from Pa

28、rkinsons disease patientsJ. Neurosci Lett, 1994,165(1-2):208-210.7Tran TA, McCoy MK, Sporn MB, et al. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotectionJ. J Neuroinflammation, 2008, 5:14.8Lin WM, Zhang YM, Moldzio R, et al. Ginsenoside Rd attenuates neuroinflammat