硫酸鈹對(duì)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞DNA損傷的劑量效應(yīng)(一)

1、硫酸鈹對(duì)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞DNA損傷的劑量效應(yīng)(一)【摘要】 目的：觀察不同劑量硫酸鈹（BeSO4）在不同時(shí)相處理后引發(fā)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂損傷的劑量效應(yīng). 方法：采用單細(xì)胞凝膠電泳法(SCGE)分別測(cè)定BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞體外染毒0.2, 2, 20, 100和200 mol/L 1 h和2 h后DNA鏈斷裂損傷情況. 結(jié)果：在不同劑量硫酸鈹染毒1 h后,脾淋巴細(xì)胞出現(xiàn)DNA鏈斷裂損傷的測(cè)定指標(biāo)在各劑量組明顯高于對(duì)照;染毒1 h 和2 h后,細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的DNA鏈斷裂損傷，但其相同劑量組之間差異無顯著性. 結(jié)論：硫酸鈹可誘發(fā)小鼠體外脾淋巴細(xì)胞的DNA鏈斷裂損傷. 【關(guān)鍵詞

2、】 硫酸鈹0引言鈹（Beryllium）及其化合物具有眾多優(yōu)良的理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于高科技工業(yè)領(lǐng)域. 國際癌癥研究中心（IARC）最新公布的對(duì)人致癌性總評(píng)價(jià)表中已將鈹及其化合物列為人類肯定致癌物1. 已知鈹及其化合物可損害機(jī)體的免疫系統(tǒng)2-4. 因此,應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）法檢測(cè)，以判斷硫酸鈹導(dǎo)致脾淋巴細(xì)胞功能異常是否由于DNA 斷裂損傷所致,對(duì)于探討鈹免疫毒性作用機(jī)制具有重要意義.1材料和方法1.1材料BALB/c小鼠, 雄性， 體質(zhì)量(202) g, 68 wk齡,二級(jí)動(dòng)物,寧夏醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 硫酸鈹（BeSO44H2O, SigmaAldrich公司); 胎牛血清(H

3、yclone公司); RPMI 1640 (Gibco公司); 低熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma公司); 正常熔點(diǎn)瓊脂糖(Sigma公司); 肌氨酸鈉(Promega公司); Tris Base (NOVEN公司); 碘化丙錠（PI, Sigma公司); 二甲基亞砜（DMSO, 北京化工廠); TritonX100 (Sigma公司); 甲醛(北京化工廠)； EDTA(天津化學(xué)試劑廠); 全磨沙載玻片；恒溫水浴箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠); 熒光顯微鏡(CK X41, Olympus); 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(BIORAD; 水平式凝膠電泳槽(DYY 33A型, 北京六一儀器廠).1.2方法1.2.1脾淋巴細(xì)胞懸液

4、的制備常規(guī)無菌取脾,用注射器內(nèi)芯加Hanks (pH 7.4, 4) 研磨,200目篩網(wǎng)過濾,用RPMI 1640完全培養(yǎng)液將其稀釋成1108個(gè)/L細(xì)胞懸液5.1.2.2細(xì)胞染毒分別取脾淋巴細(xì)胞6份于試管中, 1管加完全培養(yǎng)基作陰性對(duì)照,其余5管各加入不同濃度的BeSO4溶液,使終濃度分別為0.2, 2.0, 20.0, 100.0, 200.0 mol/L,置37恒溫水浴振蕩器孵育1 h;同樣設(shè)6管同上染毒2 h后檢測(cè). 染毒完畢后用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察染毒后的細(xì)胞存活率大于90%.1.2.3DNA鏈損傷的檢測(cè)參照Singh法6, 制片： 分別取125 mg低溶點(diǎn)瓊脂糖（LMA）和正常溶點(diǎn)瓊脂糖（

5、NMA）溶于25 mL無Ca2+, Mg2+磷酸緩沖液（PBS）中，制備成5 g/L LMA和5 g/L NMA. 在56下，將100 L 5 g/L NMA澆注到全磨砂載玻片上，蓋上蓋玻片置4，10 min使瓊脂糖固化. 在37下，將50 L細(xì)胞懸液與50 L 10 g/L新鮮配制的LMA混勻，4固化；再取75 mL 5 g/L LMA鋪至第二層瓊脂糖上，置4，10 min固化;裂解、解旋、中和：將載玻片浸入4冷裂解液（2.5 mol/L NaCl; 100 mmol/L EDTA; 10 mmol/L Tris）中裂解1 h，電泳緩沖液中避光放置 20 min；25 V， 300 mA電泳

6、20 min，TrisHCl （pH 7.5）中和3次，用50 L 5 mg/L碘化丙錠（PI）溶液染色; 分析：熒光顯微鏡下使用590 nm的綠色激發(fā)光進(jìn)行觀察，數(shù)碼相機(jī)拍照，每份樣本隨機(jī)拍攝50個(gè)DNA受損細(xì)胞，將拍攝的圖像輸入計(jì)算機(jī)（圖像設(shè)置為300400象素進(jìn)行分析）， 運(yùn)用CASP軟件計(jì)算彗星細(xì)胞的尾長、 尾矩、 Olive尾矩及尾部DNA百分含量.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行方差分析.2結(jié)果21染毒后DNA損傷的“彗星”形態(tài)學(xué)觀察染色后在熒光顯微鏡察20倍鏡下觀察可見, 陰性對(duì)照組的淋巴細(xì)胞大小比較均一，為一圓形熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣光滑，即彗星頭部，無拖尾

7、現(xiàn)象（圖1A）. BeSO4染毒作用時(shí),損傷細(xì)胞的DNA遷移表現(xiàn)為彗星頭部核心致密、周邊松散,呈刷狀緣樣；并且隨著BeSO4劑量的增加，彗星的尾巴加長，尾部的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小（圖1B,C,D,E,F）.A：陰性對(duì)照組；B：0.2 mol/L組；C：2 mol/L組；D：20 mol/L組；E：100 mol/L組；F：200 mol/L組.圖1硫酸鈹致小鼠脾淋巴細(xì)胞DNA受損形態(tài)略2.2染毒不同劑量DNA鏈損傷的檢測(cè)BeSO4染毒1 h和2 h時(shí)所致DNA鏈損傷出現(xiàn)的尾長及尾矩與對(duì)照組相比 ,各劑量組顯著增加(P0.01)，彗星尾部DNA百分含量隨著BeSO4劑

8、量的增加而增加.2.3染毒不同時(shí)間DNA鏈損傷的檢測(cè)各劑量組尾長尾矩及尾部DNA百分含量在染毒2 h組與陰性對(duì)照組相比顯著增加(P0.01)，且均高于染毒1 h組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05, 表1) .表1硫酸鈹致小鼠脾淋巴細(xì)胞DNA損傷的指標(biāo)（略）3討論鈹及其化合物是一種嚴(yán)重危害人類健康的金屬污染物，人類對(duì)其研究已有幾十年，但至今有關(guān)它的毒作用機(jī)制尚未清楚. 已知鈹及其化合物可損害機(jī)體的免疫系統(tǒng),但是否是由于DNA的損傷而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能異常，國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道. SCGE是在單細(xì)胞水平上檢測(cè)有核細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)的分子生物學(xué)毒性評(píng)價(jià)方法. DNA的損傷和腫瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系,由于SC

9、GE對(duì)低水平的DNA損傷極為敏感,因此可用于人類遺傳損傷的生物監(jiān)測(cè),特別是作為職業(yè)有害因素對(duì)健康影響的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)具有很好的應(yīng)用前景. 通常情況下，DNA雙鏈以組蛋白為核心盤旋形成核小體，在核小體中DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)，如果有去污劑進(jìn)入細(xì)胞，核蛋白被濃鹽提取，DNA便形成殘留的類核. 如果類核中DNA斷裂，就會(huì)在核外形成一個(gè)DNA暈輪，DNA斷裂將引起超螺旋松散，電泳時(shí)DNA斷片向陽極伸展，形成特征性的彗星尾. DNA受損越嚴(yán)重，含斷裂片段越多，彗星尾就越長，尾中DNA百分含量和尾長就成了DNA斷裂的重要指標(biāo). 對(duì)于DNA損傷的彗星圖像分析，目前國內(nèi)主要采用肉眼觀察測(cè)定尾長及人工判斷DNA損傷

10、程度，由于各實(shí)驗(yàn)室條件不同，操作人員對(duì)細(xì)胞DNA損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，因此主觀性強(qiáng)，精確度不夠. 我們采用國外CASP彗星圖像分析軟件，綜合考慮形狀、距離、強(qiáng)度、矩類四方面后選擇分析了彗星尾部DNA百分含量、彗星尾長、尾矩和Olive尾矩4個(gè)指標(biāo)，不僅省時(shí)省力，而且直觀、準(zhǔn)確7. 淋巴細(xì)胞被體外染毒硫酸鈹1 h, 0. 2 mol/ L時(shí)就導(dǎo)致靶細(xì)胞的DNA損傷,且與其濃度呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;隨著染毒作用時(shí)間的增加,DNA鏈損傷略有加重,但未見時(shí)間效應(yīng)關(guān)系. 硫酸鈹在低濃度下對(duì)淋巴細(xì)胞具有刺激作用. 我們?cè)诩?xì)胞毒性試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇對(duì)細(xì)胞無明顯毒性的濃度作為最高受試濃度進(jìn)行SCGE試驗(yàn), 結(jié)果表明

11、, 0.2200 mol/L的硫酸鈹均能在體外引起小鼠脾淋巴細(xì)胞DNA損傷, 且呈明顯的劑量 效應(yīng)關(guān)系. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示, 低濃度硫酸鈹盡管未對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生明顯毒性, 但可導(dǎo)致DNA損傷. 在硫酸鈹毒性作用發(fā)生過程中, DNA損傷可能起著非常重要的作用. 可以推測(cè), 正是由于DNA損傷, 導(dǎo)致淋巴細(xì)胞免疫功能的異常, 進(jìn)而影響機(jī)體的免疫功能, 但目前尚缺乏更多、更直接的證據(jù), 有關(guān)這一方面尚待進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1 江剛. 美國國家毒物學(xué)辦公室把鈹及其化合物列為人類致癌物J.中國環(huán)境科學(xué), 2000,20:206.2 Reeves AL. The immunotoxicity of berylliumJ. Immunotoxicology, 1983:261-266.3 李學(xué)軍. 慢性鈹病發(fā)生的免疫病理機(jī)制J. 職業(yè)衛(wèi)生與病傷,1995, 10(2):110-113.4 劉海濱. 鈹病發(fā)病機(jī)制和診斷的研究進(jìn)展J.工業(yè)衛(wèi)生和職業(yè)病,1997,23(4):241-243.5 段鏈,楊靜玉,于海,等.彗星試驗(yàn)中全血法與分離淋巴細(xì)胞法的比較J.癌變畸變突變,2004, 16(5):307-309.6 Signh NP, Mccoy MT, Tice