蛋白質的表達、純化及檢測-分子實驗報告

1、實驗目的1.了解外源基因在大腸桿菌細胞中的誘導表達情況2.學會用SDS-PAGE電泳法分離不同分子量的蛋白質3.學習通過親和層析法純化目的蛋白4.學會考馬斯亮藍染色法和蛋白質雜交法檢測蛋白質實驗原理1.外源基因在大腸桿菌細胞中的誘導表達：將外源基因克隆在特殊的表達載體中，讓其在E. coli中表達，該表達載體上含有l(wèi)ac操作子的啟動子。在不加誘導劑的條件下培養(yǎng)宿主菌，lacI基因表達的阻遏蛋白LacI與lac操作子結合，使外源基因不能表達；向培養(yǎng)基中加入誘導物IPTG后，LacI阻遏蛋白變構失活，不能與lac操作子結合，外源基因就表達。2.蛋白質SDS-PAGE電泳分離：SDS-PAGE是最常

2、用的定性分析蛋白質的電泳方式，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。其分離原理是根據蛋白質分子量的差異，因為SDS-PAGE的樣品處理液及緩沖液的加入破壞了蛋白質的二級、三級、四級等結構，并使SDS與蛋白質充分結合形成SDS-蛋白質復合物，穩(wěn)定地存在于均一的溶液中，SDS與蛋白質結合后使SDS-蛋白質復合物上帶有大量的負電荷，遠遠超過其原來所帶的電荷，從而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計，消除了不同分子之間原有的電荷差別，其電泳遷移率主要取決于亞基分子質量的大小，這樣分離出的譜帶也為蛋白質的亞基。3.考馬斯亮藍法檢測蛋白質：考馬斯亮藍 是一種蛋白質染料，主要有R-250和G-250兩種

3、類型?？捡R斯亮藍可以和蛋白肽鏈中堿性氨基酸殘基或芳香族氨基酸殘基（Arg， Trp， Tyr， His， Phe）結合?？捡R斯亮藍R250多用于聚丙烯酰胺凝膠電泳后蛋白質條帶的染色；因為考馬斯亮藍R250中的R代表Red，偏紅，紅藍色，與蛋白質結合雖然比較緩慢，但是染料可以穿透凝膠，染膠效果好，染色后為藍色，且與膠的結合可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。4.基因融合就是將兩個或多個開放讀碼框按一定順序連接在一起，融合閱讀框架的表達產物是一個雜和蛋白。在E. coli的 pET表達系統(tǒng)中表達N端含有His-tag（組氨酸六聚體）的融合靶蛋白，然后用親和層析的方法進行純化。多聚組氨酸能與

4、多種過渡金屬和過渡金屬螯合物結合，因此帶暴露的6 X His-tag的蛋白質能結合于固化Ni2+樹脂，從而將帶有his-tag組氨酸標簽的融合蛋白與其它蛋白區(qū)分開來。組氨酸殘基的五元咪唑環(huán)是蛋白與Ni離子作用的關鍵。當我們用高濃度的咪唑（imidazole）溶液洗脫的時侯，咪唑便與融合蛋白his-tag的咪唑環(huán)競爭結合，最終將融合蛋白洗脫下來。5.蛋白質雜交法：蛋白質雜交也稱Western blotting，首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉移到PVDF膜上，本實驗使用電泳印跡濕轉法。這種方法是用有孔的塑料和泡沫將凝膠和NC/PVDF膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進

5、行電泳，選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質在電場力的作用下離開凝膠結合到PVDF膜上。轉移后PVDF膜就稱為一個印跡（blot），用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液處理以封閉PVDF膜上剩余的疏水結合位點，而后用一抗處理，待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，清洗除去未結合的一抗，進一步用適當標記的二抗處理，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置。實驗儀器與材料、試劑1.實驗儀器：超凈工作臺、試管、搖床、離心機、垂直板電泳儀、空氣浴搖床、低溫離心機、電泳儀、超聲破碎儀等。2.實驗材料：大腸桿菌BL21；重組質粒pET-X，PVDF膜3.實驗試劑：（1）50m

6、g/ml 卡那霉素。（2）1M IPTG： （3）LB液體培養(yǎng)基(4)蛋白質Marker(5) 30 Acr/Bis （丙烯酰胺溶液(6) 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）： (7) 0.5 M Tris-Hcl（PH6.8）： (8) 10%（w/v）SDS（十二烷基磺酸鈉）溶液: (9) 10%AP（過硫酸銨溶液, AP(10) TEMED ：商品液。(11) 10X電泳緩沖液 (12) （13）1 ´ 膜轉移液(1000 ml)：（15）洗膜緩沖液TBST（16）封閉液 （3% BSA）（100ml）（17）3ml，NaCl （18）顯色液（10 ml）：（19）染

7、色液（100ml（20）脫色液（200ml）實驗步驟：1.外源基因的表達（1）種子液的制備：挑取LB固體平板上的大腸桿菌BL21（pET-X）單菌落，接種于含5l卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，37，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。(注意取菌株要在超凈工作臺上操作，一定注意無菌).（2）轉接培養(yǎng)：取50l菌液分別轉接到兩支含有5l卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基試管中（1%接種量），37、200rpm轉接培養(yǎng)。（3）IPTG誘導表達：當培養(yǎng)23小時，使其OD600值達0.6左右，開始向一支試管中加入5ul 1M 的IPTG（終濃度為1mM）進行誘導表達6小時，另一支試管作為對照不加IPTG

8、。（4） 取樣：誘導表達6小時后，取1.ml菌液， 12000rpm離心1分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。-20保存。1.1. 蛋白質變性SDS-PAGE電泳分離(1)樣品制備：取出-20保存的BL21（pET- cry9ea）菌體沉淀,加入50l 20m M Tris-HCl（pH 8.0）重懸沉淀與2X上樣緩沖液1:1混勻，同蛋白Marker一起在100沸水浴10分鐘，12000r/min4離心5分鐘，冰上放置。（2） 10分離膠制備（5ml）：架好膠板（使用0.75mm的玻璃板），配置10分離膠：去離子水 1.9 ml， 30Acr + Bis 1.7 ml，1.5 M Tris-Hcl(p

9、H 8.8) 1.3 ml，10SDS 50 ul，10AP 50 ul，TEMED 3 ul。注意：最后加AP和TEMED?；靹蚝蠹尤雰刹ＡA縫中，并小心在膠面上加入1cm蒸餾水，約40分鐘，等膠自然凝聚后傾斜倒出蒸餾水（在膠面上加入蒸餾水稱為水封，其目的是保持膠面平整和防止空氣進入，影響凝膠）。（3）5濃縮膠制備（2ml）：去離子水 1.4ml, 30Acr-Bis 0.33ml,0.5M Tris-Hcl(PH6.8) 0.25ml, 10SDS 20 ul, 10AP 20 ul,TEMED 2 ul?；靹蚝蠹尤氲讲ＡО逯?，并插入0.75mm梳子，待凝固后小心拔出梳子。（4）上樣：蛋白

10、上樣量的選擇：要根據具體情況決定，對于考馬斯亮藍染色，如果樣品為菌體蛋白樣品，有至少50條以上的條帶要顯出來，需要上樣量在15 g左右即可，如果蛋白條帶少于6條，如蛋白Marker或純化階段后期的蛋白樣品，上樣量可減少至2 g即可顯出清晰的條帶。（5）電泳：將玻璃板凝膠放入電泳槽中，并在糟中加入1X電泳緩沖液。加樣：取所制備樣品上清20ul，蛋白Maker 5 ul分別上樣。設定電泳程序：S1 80V 15min； S2 160V 1h30min1.1.1.考馬斯亮藍染色檢測蛋白質染色和脫色：電泳結束后，將膠板從電泳槽中取出，小心從玻璃板上取出凝膠，放入考馬斯亮藍染色液中，脫色搖床染色（或于微

11、波爐加熱至染色液沸騰）約2小時。將凝膠轉入另一培養(yǎng)皿，加入脫色液（用沸水煮沸脫色后），脫色搖床脫色2次，第一次1個小時，第二次0.5個小時左右，即可觀察蛋白條帶。1.2蛋白質的純化-鎳柱親和層析1. 取出-20保存的E. coli BL21/pET-X菌體沉淀（1000l菌液），加入1/10體積的結合緩沖液【0.1M Tris-HCl（pH8.0）】（100l），重懸細胞沉淀，加入1l的溶菌酶至終濃度為100g/ml，冰上放置30分鐘；2. 超聲波處理50次（超聲5秒/間10秒，約5分鐘）；3. 12000r/min，4 離心15分鐘，取上清和沉淀物；4.除上清外，所有樣品均加入100ul結合

12、緩沖液，充分混勻。5. 取beads 30-50l6. 加入500l去離子滅菌水，靜音混合器混勻20分-1小時，多次離心換水，至pH7.0.7. 掛鎳，離心去水，加入1M硫酸鎳500l，靜音混合器混勻20分-1小時，2次離心換硫酸鎳緩沖液，至pH23.8. 500l去離子滅菌水，靜音混合器混勻20分-1小時，多次離心換水，至pH7.0.9. 離心，加入500l，10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡beads，靜音混合器混勻30分。10.離心，200l含0.5M氯化鈉的10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液平衡beads，靜音混合器混勻30分。11. 稀釋樣品至200l，然后

13、在樣品中加入氯化鈉，至終濃度為0.5M。12. 取beads 約10l，加入稀釋樣品中，4，靜音混合器混勻1-2小時。13. 離心，去上清，用含0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液洗beads，每次500l，2-3次，至OD很低且穩(wěn)定。14. 15mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液（用前配置），20L，靜音混合器混勻1小時，離心取上清。15. 60mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl（pH8.0）溶液（用前配置），20L，靜音混合器混勻1小時，離心取上清。16. 300mM咪唑0.5M氯化鈉的10mMTris-HCl（pH8.0

14、）溶液（用前配置），20L，靜音混合器混勻1小時，離心取上清。17. SDS-PAGE電泳檢測。1.2.1蛋白質雜交檢測蛋白質（1）蛋白質轉膜：a準備好轉印緩沖液，把凝膠在膜轉移緩沖液中平衡60min；b剪好合適尺寸的轉印膜（PVDF膜），先在甲醇中浸10 min，轉至膜轉移緩沖液浸10min；c剪好合適尺寸的濾紙（2張增厚濾紙或4張厚濾紙或6張薄濾紙）用膜轉移緩沖液浸濕；d在轉膜儀的陽極平板上根據圖中順序做好轉印三明治，注意不能有氣泡；e裝好陰極平板，合上安全蓋；f接上合適的電泳儀開始轉印，注意電極連接（正對正，負對負）100V，45min，冰上進行。g關閉電泳儀，打開安全蓋和陰極電極，取出轉印膜；（2）封閉及雜交：h用膜轉移緩沖液漂洗10min，置于1%封閉液（blocking buffer）中，室溫，緩慢搖動45-60min，或者4過夜；i加入稀釋于3%封閉液的第一抗體，室溫，緩慢搖動4560min，或者4過夜；jTBST洗4 x 5min，TBS洗1 x 5min；k加入第二抗體（堿性磷酸酶編輯的抗鼠IgG），緩慢搖動45-60min；lTBST洗4 x 5min，TBS洗1 x 5min；（3）顯色反應：m加入10ml包含顯色底物（NBT-66l、BCIP-33l）的檢測液（顯色液），室溫，避光，靜置，觀察顏色反應；n信號達到要求后，清水漂洗，終止反