IκBα突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細胞生物學特性的影響

1、IB突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細胞生物學特性的影響    【摘要】目的 觀察IB突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性細胞因子分泌的影響。方法 在已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IBM的INPCs的基礎上，用MTT法繪制兩細胞株的生長曲線，用流式細胞儀檢測其增殖指數(shù)，以5小牛血清誘導分化后，采用western blot檢測兩株細胞的分化情況，同時用realtime RT-PCR比較TNF-、IL-1和IL-6在兩種細胞株中的表達。 結(jié)果 生長曲線及流式細胞儀測得的細胞增殖指數(shù)提示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/I

2、BM INPCs的增殖速度較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的INPCs明顯降低。經(jīng)血清誘導分化后，兩者均大量表達膠原纖維酸性蛋白；轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs IL-1和IL-6的表達減低，但TNF-表達變化無顯著性。結(jié)論 IB突變型基因可減慢INPCs的增殖，并減少部分炎性細胞因子的表達，但對INPCs的分化無顯著影響。 【關鍵詞】干細胞； NF-B抑制因子；細胞增殖；細胞分化；細胞因子 Effect of mutated IB gene on the biological characteristics of immortalized neural prog

3、enitor cell strain ZHU Chang, LIU Zhi-heng, ZHANG Chuan-han, et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, China 【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IB gene on the proliferation，differen

4、tiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IB gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs, MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index.

5、Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-、IL-1 and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was s

6、lowed down in mutated IB gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF- between mutated IB gene transfected

7、 INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1 and IL-6 was reduced in mutated IB gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IB gene can slow down the proliferation of INPCs, reduce the expression of some cytokines, but didnt influence the differentiation of INPCs. 【Key words】Ste

8、m cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines 本實驗室成功構建了SV40Tag永生化的大鼠神經(jīng)前體細胞株（INPCs）1，并在此基礎上構建了轉(zhuǎn)IB突變型基因永生化神經(jīng)前體細胞株。作為細胞移植治療的細胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學特性在轉(zhuǎn)入外源基因后有何改變，是進1步研究首先應關注的問題。本研究擬通過比較轉(zhuǎn)IB突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細胞因子分泌功能上的差異，為進1步將該轉(zhuǎn)基因細胞用于細胞移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎。

9、材料與方法 材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs由本實驗室構建，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無血清培養(yǎng)添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。 細胞培養(yǎng)及傳代 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3

10、.1/IBM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3g/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25胰酶消化傳代。 細胞生長曲線的繪制 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細胞接種12孔，每24h取出1板，每孔加入0.2MTT 50l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150l，震蕩10 min，在酶標儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。 細胞增殖指數(shù)的測定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1

11、及pcDNA3.1/IBM的INPCs分別制成單細胞懸液，PBS 洗1次后，加入-20 預冷的80 %乙醇固定, 冰浴30min，固定后的細胞用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50g/mL)和RNA酶（終濃度為1g/ml）， 室溫避光孵育1h后上機檢測，細胞增殖指數(shù)= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。 Western blot檢測細胞分化 分別提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的細胞總蛋白，兩株細胞以5血清誘導分化1周后分別提取總蛋白，以

12、-actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上, 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10g/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的2抗，室溫孵育1h，漂洗后2氨基聯(lián)苯胺顯色23 min，水洗后照相。 Realtime RT-PCR 檢測細胞因子的表達 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRN

13、A進行逆轉(zhuǎn)錄，然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進行PCR反應，反應條件為：94預變性10 s，94變性5 s，60退火及延伸20s，共反應40個循環(huán)后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2CT法分析細胞因子的的相對表達量2，引物列表見表1。 統(tǒng)計學處理采用SPSS 12. 0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（ ±s）表示，不同細胞株間比較采用成組t檢驗，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié) 果 生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM

14、 INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第1天外，各時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs低，同時點兩株細胞間比較，差異有統(tǒng)計學意義。 流式細胞儀檢測細胞增殖指數(shù) 轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的細胞增殖指數(shù)依次為61.64±4.25和46.19±0.86，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義。 Western blot檢測細胞分化 血清誘導分化后，兩株細胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導分化前，轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/

15、IBM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2） 細胞因子的表達 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs細胞因子mRNA的相對表達量，如表2所示。將轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs相應細胞因子的表達量定義為1，兩株細胞TNF-的mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs中IL-6 及IL-1 mRNA的表達較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs低，差異有統(tǒng)計學意義。 討 論 神經(jīng)前體細胞具有不斷分裂增殖

16、、自我更新以及多分化潛能3。轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的培養(yǎng)和傳代證實，轉(zhuǎn)入IB突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實，轉(zhuǎn)入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導分化后大部分細胞表達作為星形膠質(zhì)細胞標志的GFAP，分化為星形膠質(zhì)細胞，僅有少量細胞表達作為神經(jīng)元標志的MAP2，分化為神經(jīng)元。增殖和分化潛能的保持即證實了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs保持了神經(jīng)前體細胞的特性，同時也是該細胞株用于細胞移植治療的基本保證。 NF-B是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，

17、在免疫反應、炎癥、細胞生長、分化、凋亡和癌癥的發(fā)生等方面發(fā)揮多種重要的生理學功能。國內(nèi)王劍虹等人的研究證實，IB突變型基因轉(zhuǎn)入肝癌細胞后，可以抑制NF-B的活性，同時抑制癌細胞的增殖4。Widera等人的研究也證實，TNF可通過激活NF-B促進神經(jīng)干細胞的增殖，其原理可能與NF-B激活后，細胞周期蛋白D1上調(diào)有關5。本實驗也觀察到，轉(zhuǎn)入IB突變型基因后，INPCs生長減慢，細胞增殖指數(shù)降低，推測該現(xiàn)象是由于IB突變型基因下調(diào)NF-B的活性，使NF-B下游的1些促細胞增殖的基因也相應下調(diào)，減弱了細胞增殖。 1些研究證實，微環(huán)境是影響干細胞移植治療效果的重要因素6 ，細胞因子是微環(huán)境的重要成分。I

18、NPCs作為細胞移植治療的種子細胞，即受到移植處微環(huán)境的影響，同時也通過分泌TNF-、IL-6 、IL-1等細胞因子影響微環(huán)境。TNF-、IL-6 、IL-1等細胞因子是受NF-B調(diào)控的炎性細胞因子，實驗證實，在腦缺血的病理生理過程中，這些細胞因子的表達增多7，且增高的程度與缺血缺氧性腦病的臨床預后有關8。IL-6 、IL-1作為炎性細胞因子，參與缺血后炎性細胞的浸潤，TNF-影響神經(jīng)前體細胞的增殖5。IB突變型基因減少INPCs中IL-6 、IL-1 mRNA的表達，使轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs合成及分泌的炎性細胞因子減少，對微環(huán)境的影響減小，同時也使該細胞株對周邊環(huán)境中引起NF

19、-B上調(diào)的因素不敏感，從而有望改變細胞株移植后的命運。 本實驗證實，轉(zhuǎn)IB突變型基因的INPCs細胞增殖減慢，部分炎性細胞因子的表達減少，但細胞不斷增殖和多向分化的特性不受影響，神經(jīng)前體細胞基本特性的保持是轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs更進1步應用于細胞移植治療的基本保證，同時轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs對周邊環(huán)境的不敏感性有望改善細胞移植的效果。 參考文獻 1 高峰，田玉科，楊輝，等. 猿腎病毒40大T抗原基因永生化大鼠神經(jīng)前體細胞株的構建. 中華麻醉學雜志, 2005,25:597-600. 2 Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2CT method. Methods, 2001,25:402-408. 3 Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: an overview. Cire Res,2003,92:598-608. 4 王劍虹，黃慶科，陳民新. 變異IB抑制肝癌細胞株SMMC-7721中NF-B活性及細胞生長.中華肝臟病雜志，2003，4：22