IκBα突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

1、IB突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞生物學(xué)特性的影響    【摘要】目的 觀察IB突變型基因?qū)τ郎窠?jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）增殖、分化及部分炎性細(xì)胞因子分泌的影響。方法 在已經(jīng)建立的轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IBM的INPCs的基礎(chǔ)上，用MTT法繪制兩細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其增殖指數(shù)，以5小牛血清誘導(dǎo)分化后，采用western blot檢測(cè)兩株細(xì)胞的分化情況，同時(shí)用realtime RT-PCR比較TNF-、IL-1和IL-6在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)。 結(jié)果 生長(zhǎng)曲線及流式細(xì)胞儀測(cè)得的細(xì)胞增殖指數(shù)提示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/I

2、BM INPCs的增殖速度較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的INPCs明顯降低。經(jīng)血清誘導(dǎo)分化后，兩者均大量表達(dá)膠原纖維酸性蛋白；轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM的INPCs較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs IL-1和IL-6的表達(dá)減低，但TNF-表達(dá)變化無(wú)顯著性。結(jié)論 IB突變型基因可減慢INPCs的增殖，并減少部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，但對(duì)INPCs的分化無(wú)顯著影響。 【關(guān)鍵詞】干細(xì)胞； NF-B抑制因子；細(xì)胞增殖；細(xì)胞分化；細(xì)胞因子 Effect of mutated IB gene on the biological characteristics of immortalized neural prog

3、enitor cell strain ZHU Chang, LIU Zhi-heng, ZHANG Chuan-han, et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, China 【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IB gene on the proliferation，differen

4、tiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IB gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs, MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index.

5、Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-、IL-1 and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was s

6、lowed down in mutated IB gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF- between mutated IB gene transfected

7、 INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1 and IL-6 was reduced in mutated IB gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IB gene can slow down the proliferation of INPCs, reduce the expression of some cytokines, but didnt influence the differentiation of INPCs. 【Key words】Ste

8、m cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines 本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了SV40Tag永生化的大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株（INPCs）1，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了轉(zhuǎn)IB突變型基因永生化神經(jīng)前體細(xì)胞株。作為細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來(lái)源和外源基因的載體，INPCs的生物學(xué)特性在轉(zhuǎn)入外源基因后有何改變，是進(jìn)1步研究首先應(yīng)關(guān)注的問(wèn)題。本研究擬通過(guò)比較轉(zhuǎn)IB突變型基因及空白對(duì)照載體的INPCs在增殖、分化以及細(xì)胞因子分泌功能上的差異，為進(jìn)1步將該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于細(xì)胞移植治療腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定基礎(chǔ)。

9、材料與方法 材料 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，DMEM/F12培養(yǎng)基、B27無(wú)血清培養(yǎng)添加劑（Gibco公司，美國(guó)）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國(guó)）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國(guó)）；抗-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國(guó)）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1或pcDNA3

10、.1/IBM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3g/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，0.25胰酶消化傳代。 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IBM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細(xì)胞接種12孔，每24h取出1板，每孔加入0.2MTT 50l，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150l，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）上測(cè)定570nm吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線。 細(xì)胞增殖指數(shù)的測(cè)定 將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1

11、及pcDNA3.1/IBM的INPCs分別制成單細(xì)胞懸液，PBS 洗1次后，加入-20 預(yù)冷的80 %乙醇固定, 冰浴30min，固定后的細(xì)胞用PBS 洗滌2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50g/mL)和RNA酶（終濃度為1g/ml）， 室溫避光孵育1h后上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞增殖指數(shù)= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。 Western blot檢測(cè)細(xì)胞分化 分別提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的細(xì)胞總蛋白，兩株細(xì)胞以5血清誘導(dǎo)分化1周后分別提取總蛋白，以

12、-actin為內(nèi)參照，取等量的蛋白質(zhì)經(jīng)10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上, 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10g/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的2抗，室溫孵育1h，漂洗后2氨基聯(lián)苯胺顯色23 min，水洗后照相。 Realtime RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞因子的表達(dá) 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國(guó)）測(cè)定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說(shuō)明操作，用等量的總mRN

13、A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國(guó)）上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94預(yù)變性10 s，94變性5 s，60退火及延伸20s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2CT法分析細(xì)胞因子的的相對(duì)表達(dá)量2，引物列表見(jiàn)表1。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ±s）表示，不同細(xì)胞株間比較采用成組t檢驗(yàn)，P < 0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié) 果 生長(zhǎng)曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM

14、 INPCs的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。除接種后第1天外，各時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時(shí)點(diǎn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs低，同時(shí)點(diǎn)兩株細(xì)胞間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù) 轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的細(xì)胞增殖指數(shù)依次為61.64±4.25和46.19±0.86，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Western blot檢測(cè)細(xì)胞分化 血清誘導(dǎo)分化后，兩株細(xì)胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導(dǎo)分化前，轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/

15、IBM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無(wú)明顯的GFAP條帶，兩株細(xì)胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無(wú)明顯差異。（見(jiàn)圖2） 細(xì)胞因子的表達(dá) 用Realtime RT-PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)pcDNA3.1 INPCs及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量，如表2所示。將轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)量定義為1，兩株細(xì)胞TNF-的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs中IL-6 及IL-1 mRNA的表達(dá)較轉(zhuǎn)pcDNA3.1的INPCs低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 討 論 神經(jīng)前體細(xì)胞具有不斷分裂增殖

16、、自我更新以及多分化潛能3。轉(zhuǎn)pcDNA3.1INPCs 及轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs的培養(yǎng)和傳代證實(shí)，轉(zhuǎn)入IB突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過(guò)半定量的方式證實(shí)，轉(zhuǎn)入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導(dǎo)分化后大部分細(xì)胞表達(dá)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的GFAP，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，僅有少量細(xì)胞表達(dá)作為神經(jīng)元標(biāo)志的MAP2，分化為神經(jīng)元。增殖和分化潛能的保持即證實(shí)了轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs保持了神經(jīng)前體細(xì)胞的特性，同時(shí)也是該細(xì)胞株用于細(xì)胞移植治療的基本保證。 NF-B是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，

17、在免疫反應(yīng)、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和癌癥的發(fā)生等方面發(fā)揮多種重要的生理學(xué)功能。國(guó)內(nèi)王劍虹等人的研究證實(shí)，IB突變型基因轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞后，可以抑制NF-B的活性，同時(shí)抑制癌細(xì)胞的增殖4。Widera等人的研究也證實(shí)，TNF可通過(guò)激活NF-B促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，其原理可能與NF-B激活后，細(xì)胞周期蛋白D1上調(diào)有關(guān)5。本實(shí)驗(yàn)也觀察到，轉(zhuǎn)入IB突變型基因后，INPCs生長(zhǎng)減慢，細(xì)胞增殖指數(shù)降低，推測(cè)該現(xiàn)象是由于IB突變型基因下調(diào)NF-B的活性，使NF-B下游的1些促細(xì)胞增殖的基因也相應(yīng)下調(diào)，減弱了細(xì)胞增殖。 1些研究證實(shí)，微環(huán)境是影響干細(xì)胞移植治療效果的重要因素6 ，細(xì)胞因子是微環(huán)境的重要成分。I

18、NPCs作為細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞，即受到移植處微環(huán)境的影響，同時(shí)也通過(guò)分泌TNF-、IL-6 、IL-1等細(xì)胞因子影響微環(huán)境。TNF-、IL-6 、IL-1等細(xì)胞因子是受NF-B調(diào)控的炎性細(xì)胞因子，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在腦缺血的病理生理過(guò)程中，這些細(xì)胞因子的表達(dá)增多7，且增高的程度與缺血缺氧性腦病的臨床預(yù)后有關(guān)8。IL-6 、IL-1作為炎性細(xì)胞因子，參與缺血后炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，TNF-影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖5。IB突變型基因減少I(mǎi)NPCs中IL-6 、IL-1 mRNA的表達(dá)，使轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs合成及分泌的炎性細(xì)胞因子減少，對(duì)微環(huán)境的影響減小，同時(shí)也使該細(xì)胞株對(duì)周邊環(huán)境中引起NF

19、-B上調(diào)的因素不敏感，從而有望改變細(xì)胞株移植后的命運(yùn)。 本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)IB突變型基因的INPCs細(xì)胞增殖減慢，部分炎性細(xì)胞因子的表達(dá)減少，但細(xì)胞不斷增殖和多向分化的特性不受影響，神經(jīng)前體細(xì)胞基本特性的保持是轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs更進(jìn)1步應(yīng)用于細(xì)胞移植治療的基本保證，同時(shí)轉(zhuǎn)pcDNA3.1/IBM INPCs對(duì)周邊環(huán)境的不敏感性有望改善細(xì)胞移植的效果。 參考文獻(xiàn) 1 高峰，田玉科，楊輝，等. 猿腎病毒40大T抗原基因永生化大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞株的構(gòu)建. 中華麻醉學(xué)雜志, 2005,25:597-600. 2 Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2CT method. Methods, 2001,25:402-408. 3 Galli R, Gritti A, Bonfanti L, et al. Neural stem cell: an overview. Cire Res,2003,92:598-608. 4 王劍虹，黃慶科，陳民新. 變異IB抑制肝癌細(xì)胞株SMMC-7721中NF-B活性及細(xì)胞生長(zhǎng).中華肝臟病雜志，2003，4：22