間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控功能研究新進(jìn)展

1、間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)控功能研究新進(jìn)展         【摘要】  間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是具有自我更新和多向分化能力的成體干細(xì)胞的一種。近年來的相關(guān)研究表明， MSC具有低免疫原性，它可以通過抑制淋巴細(xì)胞的增殖、抑制抗原呈遞細(xì)胞分化成熟及功能發(fā)揮、抑制CTL形成、增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例等多種途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，MSC輸注能夠延長(zhǎng)狒狒異體皮膚移植的存活時(shí)間，可減輕小鼠實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦脊髓膜炎。在臨床上，MSC應(yīng)用于異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿

2、主病的預(yù)防和治療效果顯著。本文對(duì)MSC的免疫學(xué)特性及其在體內(nèi)外試驗(yàn)中發(fā)揮的免疫調(diào)控功能的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。 【關(guān)鍵詞】  移植物抗宿主病   Recent Advance in Research on  Immunomodulatory Function of Mesenchymal Stem Cells Review   Abstract   Mesenchymal stem cells (MSCs) are a kind  of adult stem cells which have the cap

3、ability to differentiate into multiple cell types as well as selfrenew continuously. Recent studies demonstrate that MSCs are low immunogenic and able to exert immunomodulatory function by various approaches, such as suppression of the lymphocyte proliferation, reduction of the dentritic cell genera

4、tion, maturation and function,  downregulation of the CTL formation and enhacement of regulatory Tcell proportion. In vivo experiments show that MSC infusion can prolong the survival time of alloskin graft in baboon and ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Successful re

5、ports have been documented about clinical application of MSC in the management of graftversushost disease. In this review, the immunological characteristics and the immunomodulation functions in vitro and in vivo of MSC were summarized.   Key words   mesenchymal stem cells; 

6、  immunomodulation;   graftversushost disease   J Exp Hematol 2007; 15(5):1117-1120   間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是具有自我更新和多向分化為骨、脂肪、軟骨等中胚層細(xì)胞的一種成體干細(xì)胞?，F(xiàn)在人們已可以從多種物種的成體的多種組織中分離出MSC，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證明了MSC及其分化細(xì)胞可給予造血細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能上的支持，具有造血調(diào)節(jié)作用。MSC成為了組織工程和骨髓移植細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)。近年來，MSC的免

7、疫調(diào)節(jié)功能逐漸受到人們的重視。   MSC表面分子免疫特性與異基因識(shí)別   MSC細(xì)胞表面只表達(dá)中等量MHCI類分子，但不表達(dá)MHC類分子及共刺激分子，如CD80、CD86、CD40和CD40L等。但將MSC裂解后，用Western blot方法可檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)存在痕量的MHC分子；經(jīng)IFN誘導(dǎo)12天后，MHC分子由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上。 Krampera等1應(yīng)用不表達(dá)MHCI和MHC分子的MSC細(xì)胞系，而Potian等2應(yīng)用表達(dá)MHCI和MHC分子的MSC，他們研究發(fā)現(xiàn)二者均未引起免疫反應(yīng)并發(fā)揮了相似的免疫抑制作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MHC分子表達(dá)與否與

8、MSC的免疫原性及免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮并沒有直接的聯(lián)系。MSC具有著低免疫原性，提示體外培養(yǎng)和體內(nèi)輸注MSC都不會(huì)引起T細(xì)胞的活化和增殖。MSC與胸腺上皮有部分相同的表面分子，如： VCAM1、ICAM2、LFA3，能介導(dǎo)其與T細(xì)胞間的相互作用，這可能是MSC免疫調(diào)控作用的分子學(xué)基礎(chǔ)。   MSC在體外實(shí)驗(yàn)中抑制T淋巴細(xì)胞的增殖   越來越多的資料表明，MSC在體外實(shí)驗(yàn)的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction, MLR）、絲裂原刺激的淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(lymphocyte transformation test, LTT)以

9、及CD3或CD28抗體刺激的淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中均能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，其中CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的增殖均被抑制。這種抑制作用有劑量依賴性，在MSC加入體系中一開始就表現(xiàn)出最大的抑制效果，晚些加入相同劑量的MSC只能保留部分抑制效果，呈時(shí)間依賴性。在用Transwell將人MSC與體系分隔培養(yǎng)時(shí)，MSC仍可發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，說明MSC的這種免疫抑制作用可能是由于可溶性因子介導(dǎo)的3，4。與之相矛盾的是，另有應(yīng)用MSC的培養(yǎng)上清液或transwell培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中并沒有觀察到抑制效果1。 Rasmusson等5發(fā)現(xiàn)，MSC可能是通過不同機(jī)制來抑制絲裂原和異體細(xì)胞刺激的淋巴細(xì)胞增殖的。在ML

10、R中，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)上清液，發(fā)現(xiàn)MSC提高了體系中IL2和可溶性IL2R的量，而在LTT體系中均有降低；在MLR體系中加入10% MSC則可提高IL10的分泌，而在LTT體系中卻無(wú)此效應(yīng)；在MLR體系中加入消炎痛，一種前列腺素合成抑制劑，能部分降低MSC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，而在LTT體系中沒有觀察到此效果。Sun等6實(shí)驗(yàn)表明，同種、異種或第三者小鼠MSC都能夠抑制異體T細(xì)胞刺激的淋巴細(xì)胞的增殖，并且有相同報(bào)道，第三者M(jìn)SC比自體MSC具有更強(qiáng)的抑制效果7。Djouad 等8也證實(shí)，在人MLR體系中，人源性和鼠源性MSC均能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，此結(jié)果說明這種抑制作用并沒有種屬特異性

11、。   CD4+CD25+的細(xì)胞在自體免疫調(diào)節(jié)方面起著重要作用，因此人們將此群細(xì)胞定義為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Treg）。 Treg在人外周血中占CD4+細(xì)胞的5%-10%左右。據(jù)報(bào)道，在MLR體系中加入第三者M(jìn)SC,能顯著提高CD4+CD25bright 、CD4+CTLA4+和CD4+CD25+CTLA4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例, 而加入自體MSC效果不明顯7。在IL2刺激的PBMNC增殖的體系中，MSC亦能提高CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的比例9。但如果將CD4+細(xì)胞中CD25+細(xì)胞去除后再用異種單個(gè)核細(xì)胞加以刺激， 則MSC的共培養(yǎng)對(duì)

12、Treg細(xì)胞的比例不產(chǎn)生任何影響，此結(jié)果意味著MSC可能是在免疫反應(yīng)中提高Treg細(xì)胞的擴(kuò)增潛能，而不是通過促進(jìn)幼稚CD4+ T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞而發(fā)揮免疫調(diào)控作用的10。   MSC與抗原呈遞細(xì)胞   外源性抗原可在局部或通過淋巴液和血液轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴組織，被該部位抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells,  APCs）攝取、加工、處理，以抗原肽MHC類分子復(fù)合物的形式表達(dá)于APC表面，供特異性CD4+Th細(xì)胞識(shí)別。APC識(shí)別和呈遞抗原給T淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫反應(yīng)的第一步，因此人們?cè)谘芯縈SC的免疫調(diào)節(jié)功能時(shí)也非常關(guān)心MS

13、C對(duì)APC有何影響。樹突狀細(xì)胞（dentritic cells, DC）是激活初始T細(xì)胞最重要的APC。Jiang等8證明，MSC抑制了CD14+單核細(xì)胞向DC的分化； MSC在DC成熟的過程中下調(diào)了APC相關(guān)分子，如CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86和HLADR的表達(dá)，體系中如去除MSC并加入DC的誘導(dǎo)劑后可逆反這種抑制作用，這說明此作用是可逆的；與MSC共培養(yǎng)后的DC與單純DC相比，其刺激CD4+增殖的能力有所減弱，炎性因子如IFN、IL12、TNF分泌減少，炎性抑制因子如IL10分泌增加。最近，Nauta等11報(bào)道了MSC不僅對(duì)單核細(xì)胞來源DC，并且對(duì)CD34+細(xì)胞來源DC

14、的分化和功能也有抑制作用。雖然在MSC抑制CD3和CD28抗體刺激的T細(xì)胞的增殖的體系中無(wú)APC的存在，但此研究結(jié)果提示， MSC抑制DC的發(fā)育與成熟是其免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制之一。   MSC與細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)   對(duì)移植后清除異體細(xì)胞和感染時(shí)清除感染細(xì)胞，NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性的殺傷性T細(xì)胞(CTL)是發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的重要靶細(xì)胞。人們對(duì)MSC與細(xì)胞毒作用的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究。Rasmusson等13發(fā)現(xiàn)，如果一開始就在第6天的MLR體系中加入MSC，其CTL介導(dǎo)的細(xì)胞溶解效應(yīng)將降低70%，然而在第3天加入MSC，因?yàn)镃TL已形成，則對(duì)細(xì)胞溶解效應(yīng)沒有任

15、何影響。當(dāng)把MSC和淋巴細(xì)胞用Transwell分離培養(yǎng)，MSC仍具有抑制CTL形成的作用，說明MSC是通過可溶性分子的分泌發(fā)揮此作用的。但是，MSC并沒有減弱NK細(xì)胞對(duì)K562腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，MSC本身也不能引起淋巴細(xì)胞增殖和被CTL或NK所溶解。這些結(jié)果可能意味著在造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）后，MSC輸注可能將降低CTL形成以減輕移植物抗宿主?。╣raftversushost disease, GVHD)的發(fā)生；另一方面，MSC輸注不影響NK細(xì)胞對(duì)殘余腫瘤細(xì)胞的殺傷，可以將GVHD和移植物抗腫瘤（graf

16、tversusleukemia, GVL）效應(yīng)分開，發(fā)揮雙重有利作用。Potian等2也報(bào)道了相似的結(jié)果。他們?cè)贛LR中用同一供者的PBMNC和（或）MSC來刺激異體PBMNC以誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL。結(jié)果PBMNC刺激產(chǎn)生了大量的CTL，當(dāng)體系中加入一定劑量的MSC， MSC可減少CTL的形成，抑制針對(duì)于異基因反應(yīng)的細(xì)胞毒性作用，并呈劑量依賴性，而MSC本身并不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生CTL以溶解靶細(xì)胞。在對(duì)淋巴細(xì)胞亞型增殖情況的分析發(fā)現(xiàn)，由于MSC提高了CD4+淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增比例，CTL和NK細(xì)胞就相對(duì)變少。此實(shí)驗(yàn)說明，通過改變細(xì)胞比例可能是MSC發(fā)揮抑制細(xì)胞毒效應(yīng)的機(jī)制之一14。有相似實(shí)驗(yàn)證明，MSC能抑制I

17、L2刺激的NK細(xì)胞IFN分泌，而MSC本身不引起NK細(xì)胞的IFN分泌9。   MSC體內(nèi)免疫抑制作用   MSC的這些免疫學(xué)特性激起了眾多科學(xué)家的研究熱情，人們?cè)趯?duì)MSC體外的免疫調(diào)控作用進(jìn)行大量細(xì)致研究的同時(shí)，對(duì)MSC體內(nèi)是否也具有此作用，是否能在今后的疾病治療中服務(wù)人類進(jìn)行了積極探索。2002年Bartholomew等15發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注狒狒骨髓來源的MSC能延長(zhǎng)狒狒異體皮膚移植存活時(shí)間： 11.3±0.3 vs 7±0天。Guo等16也證明小鼠骨實(shí)質(zhì)MSC的輸注能延長(zhǎng)小鼠異體皮膚移植存活時(shí)間。其病理結(jié)果表明炎性細(xì)胞的侵潤(rùn)和壞死明顯

18、減輕。2003年Djouad等7從兩方面證實(shí)了MSC的體內(nèi)免疫作用。他們將異基因MSC輸入具有免疫活性的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSC能夠植入并形成新生異基因骨，雖然骨組織沒被排斥，但在其周圍發(fā)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)。此結(jié)果說明雖然小鼠MSC在體內(nèi)具有免疫調(diào)控作用，但仍具有一定的免疫原性。小鼠的實(shí)驗(yàn)性自體免疫性腦脊髓膜炎（experimental autoimmune encephalomyelits, EAE）是反映人的多發(fā)性硬化的小鼠疾病模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在EAE發(fā)生之前或炎癥高峰期靜脈輸注小鼠MSC，可減輕EAE癥狀，其病理檢查顯示MSC輸注減輕了中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞侵潤(rùn)和脫髓鞘現(xiàn)象。然而在疾病穩(wěn)定后，M

19、SC輸注卻沒有任何治療效果。通過綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染以示蹤MSC體內(nèi)分布，可在淋巴器官發(fā)現(xiàn)MSC的存在17。機(jī)體免疫抑制狀態(tài)固然是對(duì)許多疾病的治療起到至關(guān)重要的作用，但對(duì)腫瘤的殺滅和復(fù)發(fā)就是一個(gè)不利方面。Djouad等7發(fā)現(xiàn)，MSC在體外實(shí)驗(yàn)中具有抑制CTL形成的作用，但并沒有減弱NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。關(guān)于MSC的免疫調(diào)控作用和腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系他們作了以下體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：把黑色素瘤細(xì)胞皮下注入具有免疫能力的小鼠，然后將MSC靜脈輸注或皮下輸注在腫瘤細(xì)胞的周圍，結(jié)果MSC促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而單純MSC輸注和腫瘤細(xì)胞的移植并不能在具有免疫能力的這種小鼠體內(nèi)形成腫塊7。所以在利用MSC的免疫調(diào)節(jié)功能

20、有利的一面時(shí)，還必須同時(shí)考察此功能的有弊一面，應(yīng)從整體水平考慮MSC移植后在體內(nèi)所發(fā)揮的功能。            MSC與GVHD   20世紀(jì)90年代以來，造血干細(xì)胞移植技術(shù)飛速進(jìn)展，更為安全有效，已成為治愈多種良性、惡性血液病與遺傳性疾病的重要手段，治愈的病種還在不斷的擴(kuò)大。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)等待造血干細(xì)胞移植的患者有幾百萬(wàn)，僅白血病患者1年就新增4萬(wàn)人以上，其中半數(shù)以上是兒童，因白血病死亡的人數(shù)已超過3.6萬(wàn)。能尋找到與配型相合的骨髓，并進(jìn)行造血干細(xì)胞移植治療，是目前

21、能夠使他們生存的一種很有效方法。HLAI類抗原和HLA類抗原的成分皆隨人而異，具有極大的個(gè)體差異性，同胞兄弟姐妹中僅有1/4的機(jī)會(huì)完全相同，無(wú)血緣關(guān)系的人群中HLA完全相同的機(jī)會(huì)極少，約幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)分之一。GVHD是HSCT后長(zhǎng)期存在的最棘手問題,在雙胞胎HSCT中GVHD發(fā)生率為1%-5%，親屬中為36%，非血緣關(guān)系為50%-70%。產(chǎn)生GVHD的免疫應(yīng)答是一個(gè)涉及供者T細(xì)胞和NK細(xì)胞與受者特異細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過程,是由細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞靶細(xì)胞相互作用共同介導(dǎo)的,并可導(dǎo)致多臟器損傷。目前，人們對(duì)預(yù)防和治療GVHD進(jìn)行著不斷的探索。因?yàn)镸SC可以通過抑制DC的誘導(dǎo)產(chǎn)生、延遲DC的成熟、降低T

22、細(xì)胞的增殖、減少了CTL的形成等多種機(jī)制發(fā)揮免疫調(diào)控作用，因此，MSC輸注可能是預(yù)防和治療GVHD的一種細(xì)胞治療途徑。最早在1995年，Lazarus等18對(duì)MSC輸注以抑制GVHD的效果進(jìn)行了體內(nèi)研究。他們?cè)趯?duì)1例23歲處于完全緩解期的血液系統(tǒng)腫瘤患者的自體骨髓MSC進(jìn)行了分離擴(kuò)增，采取了在HSCT時(shí)合并MSC的共輸注的治療方案，此方案很好地促進(jìn)HSC植入并有效地抑制了GVHD的發(fā)生。2005年Lazarus等19又將46例血液系統(tǒng)腫瘤患者進(jìn)行了HLA相合的異體MSC和HSC共移植的治療，在HSC移植前4小時(shí)靜脈輸注MSC，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)針對(duì)異體MSC的排斥反應(yīng)、異位組織的形成和GVHD發(fā)生的

23、提高等不良反應(yīng)。2002年Lee等20的1個(gè)病例報(bào)道也證實(shí)了這一結(jié)果。1例20歲的急性髓系白血病的患者，接受了其父親的相合的HSC和MSC的共移植，經(jīng)過31個(gè)月的病情追蹤，驚喜地發(fā)現(xiàn)此患者得到了快速的植入，而沒有急性GVHD的發(fā)生。2004年，Le Blanc等21報(bào)道了1個(gè)9歲淋巴母細(xì)胞瘤白血病男孩接受了HLA3/6相合的女性HSCT治療，術(shù)后發(fā)生了級(jí)GVHD，分別在第73天和第170天進(jìn)行了其母親的MSC輸注，此患者奇跡般地迅速好轉(zhuǎn)并在第220天治愈出院。這些研究均說明了MSC輸注可安全有效地促進(jìn)HSC植入和預(yù)防GVHD。美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部已將應(yīng)用MSC治療GVHD納入了臨床治療階段，但MSC

24、在體內(nèi)發(fā)揮作用的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。   結(jié)   語(yǔ)   MSC具有低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用，使其成為現(xiàn)代研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)在人們已可以從多種物種的多種成體組織中分離出MSC, 來源廣泛，且異體MSC比自體MSC更易獲得，所以MSC這種低免疫原性和第三者M(jìn)SC具有更強(qiáng)的免疫抑制作用使MSC的異基因移植具有更廣闊的應(yīng)用前景。希望通過對(duì)MSC免疫調(diào)控的系統(tǒng)研究，使MSC能夠作為一種通用型的細(xì)胞制劑，為人類的疾病提供  1Krampera M, Glennie S, Dyaon J，et al. Bone marro

25、w mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigenspecific T cells to their cognate peptide. Blood, 2003;101:3722-37292Potian JA, Aviv H, Ponzio NM, et al. Vetolike activity of mesenchymal stem cells: functional discrimination between cellular responses to alloantigens and rec

26、all antigens. J Immunol, 2003;171:3426-34343Klyushnenkova E, Mosca JD, Zernetkina V, et al. T cell responses to allogeneic human mesenchymal stem cells: immunogenicity, tolerance, and suppression. J Biomed Sci, 2005;12:47-574DiNicola M, CarloStella C, Magni M, et al. Human bone marrow stromal cells

27、suppress Tlymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood, 2002;99:3838-38435Rasmusson I, Ringden O, Sundberg B, et al. Mesenchymal stem cells inhibit lymphocyte proliferation by mitrogens and alloantigens by different mechanisms. Exp Cell Res, 2005; 305：33-416Su

28、n S，Guo Z，Xiao X，et al. Isolation of mouse marrow mesenchymal progenitors by a novel and reliable method. Stem Cell, 2003;21:527-5357Maccario R, Podesta M, Moretta A, et al. Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigenspecific immune response favors the differentiation of CD4+Tcell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype. Haematologica, 2005;90:516-5258Djouad F, Plence P, Bony C, et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals. Blood, 2003;102: 383