腸胃清對多藥耐藥人口腔表皮癌細(xì)胞KB

1、    腸胃清對多藥耐藥人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1移植瘤和正常組織中阿霉素濃度的影響            作者：時間：2007-11-22 11:13:00                        &

2、#160;       作者：孔令偉，范忠澤，許建華，孫 玨，朱美華，李 琦，韓建宏，石曉蘭【摘要】  目的  觀察中藥復(fù)方腸胃清口服液對腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，以及對瘤組織和正常組織中化療藥物分布的影響，探討中藥增效減毒的作用機(jī)制。方法  將具有多藥耐藥表型的人口腔表皮癌細(xì)胞株KB-A-1皮下注射接種于裸小鼠右側(cè)腋下，隨機(jī)分為5組：空白對照組，腸胃清組，阿霉素組，阿霉素+低濃度腸胃清實驗藥物組，阿霉素+腸胃清高濃度實驗藥物組。腫瘤稱重、HPLC分析、流式細(xì)胞儀檢測各組藥物的抑瘤率、阿霉素在腫瘤組織與肝腎

3、中的分布及腫瘤細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果  阿霉素和腸胃清單獨給藥均不能抑制腫瘤組織的生長，阿霉素與腸胃清聯(lián)合治療能顯著減少腫瘤組織的重量，增加腫瘤組織內(nèi)的阿霉素濃度，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。阿霉素與腸胃清聯(lián)合治療沒有影響肝臟和腎臟組織阿霉素濃度。結(jié)論  腸胃清在不影響正常組織阿霉素濃度的同時，通過增加阿霉素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累而增強(qiáng)阿霉素的細(xì)胞毒性，從而抑制腫瘤組織的生長，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥。        【關(guān)鍵詞】  腸胃清口服液；人口腔表皮癌細(xì)胞KB-A-1；多藥耐藥    

4、;            【Abstract】  Objective  To observe the effect of Changweiqing oral liquid(CWQ) on reversal of mulitdrug resistance and the effect on concentration of DOX(doxorubicin) in tumor  and normal tissue. Methods  The huma

5、n oral epidermoid carcinoma cell lines KB-A-1， which were mulitdrug resistance， were injected s.c. into the right flank area of the nude mice， which were randomized into 5 groups： control group， CWQ group， DOX group ，DOX plus CWQ (12.5g/kg) group and DOX plus CWQ (50g/kg) group. The tumor masses wer

6、e  weighted and the tumor inhibition rates were calculated； the concentration of DOX in tumor and normal tissue( livers and kidneys) were analyzed by high performance liquid chromatography； the apoptotic rate of cancer cells were detected by flow cytometry.Results  The growth of tumors was

7、 not inhibited in DOX and CWQ groups， the weight of tumor masses were all smaller in DOX plus CWQ (12.5g/kg) group and DOX plus CWQ (50g/kg) group than that in other groups.The concentration of DOX in tumor and the apoptotic rate in cancer cell were all higher in DOX plus CWQ  group than that i

8、n other groups. There were no significant difference between the concentration of DOX in livers and kidneys of every groups.Conclusion  CWQ can inhibit the growth of tumor and reverse mulitdrug resistance of tumor by increasing the concentration of DOX in tumor ， while the concentration of DOX

9、in normal tissues didnt change.        【Key words】  Changweiqing oral liquid；human oral epidermoid carcinoma KB-A-1；mulitdrug resistance         多藥耐藥（multidrug resistance， MDR）是腫瘤化學(xué)治療提高療效的最大障礙，許多化療增敏劑在提高療效的同時，往往存在嚴(yán)重的毒副作用，限制了臨床應(yīng)用1。許多研究表

10、明，中醫(yī)藥在輔助化療藥治療惡性腫瘤時，一方面可增強(qiáng)化療藥的治療效果，另一方面可減輕化療藥的毒副作用，其機(jī)制尚未被完全闡明，是否對腫瘤組織和正常組織中化療藥分布有不同的影響尚未見報道2。我們既往的研究表明，中藥復(fù)方腸胃清口服液可抑制移植瘤的生長，并可明顯提高小鼠脾臟及胸腺指數(shù)3，本研究建立多藥耐藥移植瘤模型，重點觀察腸胃清對化療藥的增效作用，以及對瘤組織和正常組織中化療藥分布的影響，闡明腸胃清增效減毒的作用機(jī)制。        1  材料與方法        1.1&

11、#160; 材料  細(xì)胞株：KB-A-1是人口腔表皮癌耐藥細(xì)胞系。此細(xì)胞株由Ira Pastan博士和Micheal.M. Gottesman博士饋贈（National Institutes of Health， USA）。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱，在37，5% CO295空氣條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM，加入10%小牛血清，加入氨芐青霉素、硫酸鏈霉素至終濃度各100uml，培養(yǎng)基中加入1.0g/ml 阿霉素（doxorubicin，DOX）。動物：BLAB/c nu/nu 裸小鼠，雄性，46周齡，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，按照SPF條件飼養(yǎng)。腸胃清口服液由黃芪、黨參、白術(shù)、石見穿、野

12、葡萄藤等藥物組成，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑室提供，生藥濃度為1.33g/ml。        1.2  人表皮癌細(xì)胞KB-A-1異種移植模型的建立4  單層培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用PBS懸浮混勻至約3×107cells/ml，以5×106cells/0.2ml濃度皮下注射接種于裸小鼠右側(cè)腋下，3周后，處死動物，迅速將腫瘤組織解剖下來，剪碎，通過網(wǎng)篩過濾，用PBS吹打成2×107cells/ml細(xì)胞懸液，以2×106 cells/0.1ml濃度皮下注射接種于裸小鼠右側(cè)

13、腋下，當(dāng)腫瘤組織生長到5mm×5mm大小時開始給藥處理。        1.3  動物分組及治療方法  將上述長有腫瘤的裸小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，分別是：空白對照組：注射生理鹽水（腹腔注射），每天1次；腸胃清組：（50g/kg，每天1次灌胃，第19天給藥）；DOX組：（2mg/kg，腹腔注射，每天1次，第2、4、6、8天給藥）；DOX+低濃度腸胃清實驗藥物組：（腸胃清為12.5g/kg，給藥方案同組；DOX的給藥方案同組）；DOX+腸胃清高濃度實驗藥物組：（腸胃清為50g/kg，給藥方案同組；DOX的

14、給藥方案同組）。        在DOX和腸胃清同時需要給藥日，腸胃清腹腔注射后5h再腹腔注射DOX。每隔3天稱量1次體重，并記錄對動物的行為觀察。全部動物在給藥處理后18天時用乙醚麻醉后處死，迅速取出腫瘤稱重。        1.4  腫瘤和正常組織內(nèi)DOX濃度的測定  通過HPLC分析，對腫瘤、肝臟和腎臟內(nèi)的DOX濃度進(jìn)行定量測定，以確定腸胃清對DOX在被移植腫瘤的裸小鼠體內(nèi)的分布的影響。具體實驗步驟如下：在裝有0.02M KH2PO4緩沖液（pH3.

15、8）中，將取出組織以1：5 W/V比例充分勻漿，加入30l KH2PO4、60l 33% AgNO3、40l 內(nèi)標(biāo)（柔紅霉素，daunorubicin）和390l 80乙腈水溶液至300l組織勻漿液，旋渦振蕩2min以混合均勻，3000rpm，4離心10min以沉淀蛋白質(zhì)，去100l用于HPLC分析，HPLC體系為：熒光檢測器，激活波長495nm，發(fā)射波長560nm；固定相為C18反相柱（5m，安捷倫）250mm×4.6mm；流動相為5mM 磷酸甲醇異丙醇乙腈（8：7：3：2，體積比）；流速為0.7ml/min。每個樣品測定3次，取平均值.數(shù)據(jù)以DOX峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值表示，計

16、算出組織內(nèi)的DOX濃度。        1.5  腫瘤組織內(nèi)凋亡的檢測  腫瘤組織被稱重后立即置于10ml預(yù)冷的PBS（含有0.2%牛血清白蛋白、0.01mol/l EDTA和10mg/ml脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease  I）剪碎組織，在玻璃勻漿器中充分勻漿，緩慢通過40m孔徑尼龍膜，過濾，濾過的液體以500×g，在室溫下離心10min，用500l含有BSA的PBS吹打沉淀成為細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中，用預(yù)冷的70乙醇（溶解于PBS）在4固定8h，加入R

17、Nase （終濃度為20g/ml）在37溫育30min，用終濃度為50g/ml的碘化丙錠（propidium iodide，PI）染色，使用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測DNA含量，CELLQUEST 軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，亞二倍體峰被定量，作為測定凋亡的標(biāo)準(zhǔn)。        1.6  統(tǒng)計學(xué)方法  數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，通過t檢驗和ANOVA檢驗分析。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。        2  結(jié)果&#

18、160;       2.1  腸胃清對體內(nèi)MDR腫瘤的增殖抑制作用  研究結(jié)果如表1所示，DOX和腸胃清分別單獨給藥治療均不能抑制腫瘤組織的生長，它    們的瘤重抑制率分別只有4.55%和3.15%。與此相對，DOX與腸胃清聯(lián)合給藥治療則能夠顯著減少腫瘤組織的重量，瘤重抑制率接近50，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理差異有非常顯著性（P<0.01）。表1  腸胃清對耐藥性KB-A-1細(xì)胞移植瘤針對阿霉素的增敏作用  (x±s)0 " align=basel

19、ine border=0>    2.2  腸胃清對腫瘤和正常組織中的阿霉素濃度的影響  結(jié)果如圖1所示，DOX與腸胃清聯(lián)合給藥組的腫瘤組織內(nèi)的DOX濃度比DOX單獨給藥組的高61（P<0.01）。在DOX單獨給藥組和DOX與腸胃清聯(lián)合給藥組中，肝臟和腎臟組織內(nèi)的DOX濃度均沒有明顯變化（P0.05）。0 " align=baseline border=0>圖1  腸胃清對腫瘤、肝臟和腎臟中的DOX濃度的影響1，腫瘤組織； 2，肝臟； 3，腎臟(*P<0.01)    2

20、.3  腸胃清對腫瘤組織中阿霉素誘導(dǎo)凋亡的增強(qiáng)作用  如圖2，3所示，腸胃清和DOX均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，與對照組相比差異有顯著性（P<0.05或P<0.01），腸胃清與DOX聯(lián)合給藥組的凋亡水平明顯增高，比DOX單獨給藥組高175（P<0.01）。0 " align=baseline border=0>圖2  流式細(xì)胞儀對小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的Apoptosis的分析0 " align=baseline border=0>圖3  流式細(xì)胞儀對腫瘤組織中的凋亡水平的定量分析0，空白組；1，腸胃清組；2，D

21、ox組；3，Dox+腸胃清組 (*P<0.05，*P<0.01)    3  討論        通過建立人表皮癌細(xì)胞異種移植模型，我們對腸胃清在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MDR的效應(yīng)進(jìn)行了評價。DOX和腸胃清分別單獨給藥治療均不能抑制腫瘤組織的生長，它們的瘤重抑制率分別只有4.55%和3.15%。與此相對，DOX與腸胃清聯(lián)合給藥治療則能夠顯著減少腫瘤組織的重量，瘤重抑制率接近50。結(jié)果顯示DOX與腸胃清聯(lián)合給藥后能夠有效地逆轉(zhuǎn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的MDR表型。   

22、    MDR細(xì)胞的一個顯著特點就是：腫瘤細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物濃度水平很低，而且這些藥物的流出速率比敏感性細(xì)胞快。MDR的腫瘤細(xì)胞就是通過提高藥物流出的速度和降低藥物流入細(xì)胞的速度，使細(xì)胞內(nèi)實際作用的抗癌藥物濃度顯著降低，從而減弱了抗癌藥物在細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒性作用5。因此，耐藥性細(xì)胞KB-A-1的多藥耐藥性是與胞內(nèi)的抗腫瘤藥物濃度降低直接相關(guān)的。為了研究腸胃清在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的作用機(jī)制，通過HPLC定量分析，我們考察了腸胃清對裸小鼠體內(nèi)的腫瘤組織中的DOX濃度的影響。研究表明DOX與腸胃清聯(lián)合給藥組的腫瘤組織內(nèi)的DOX濃度比DOX單獨給藥組高61，這一結(jié)果表明，腸胃

23、清能夠在體內(nèi)顯著增加耐藥型腫瘤細(xì)胞KB-A-1對抗腫瘤藥物DOX的敏感性。        在以往的研究中，人們發(fā)現(xiàn)很多MDR逆轉(zhuǎn)劑在臨床試驗中表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒副作用如心臟毒性，或者增加抗腫瘤藥物引發(fā)的對正常組織的毒性作用。因此，為了考察腸胃清是否會增加DOX對正常組織的毒性作用，我們同時還檢測了肝臟和腎臟組織（作為正常組織的代表）內(nèi)的DOX濃度。實驗結(jié)果表明，在DOX單獨給藥組和DOX與腸胃清聯(lián)合給藥組中，肝臟和腎臟組織內(nèi)的DOX濃度都沒有明顯變化。這一發(fā)現(xiàn)提示，在被移植腫瘤的小鼠體內(nèi)，腸胃清似乎沒有增加DOX所引發(fā)的對正常組織的毒性作

24、用。        作為常用化療藥物的DOX，在一個較低的濃度下，具有誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞毒性作用，其作用機(jī)制是DOX分子結(jié)構(gòu)的平面部分嵌入到DNA的雙鏈中形成穩(wěn)定的復(fù)合物，影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，阻止DNA復(fù)制和RNA的合成，還能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖6。我們采用流式細(xì)胞儀的方法定量測定了腫瘤細(xì)胞的DNA含量的變化，以亞二倍體的峰作為凋亡的標(biāo)準(zhǔn)。說明腸胃清能夠增強(qiáng)DOX的細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。腸胃清的這種化學(xué)增敏作用與我們觀察到的腫瘤組織內(nèi)的DOX濃度增加的結(jié)果是一致的，進(jìn)一步說明腸胃清通過增加DOX在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的積累而增強(qiáng)了DOX的細(xì)胞毒性，從而抑制了腫瘤組織的生長，導(dǎo)致瘤塊重量顯著減少，耐藥性得以被逆轉(zhuǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】    1  Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer：an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoptotein.Cancer Control，2003，10(2)：159-165.    &#